程海星，郭月英，任霆，張靜，王樂(lè)，張利霞，靳燁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于獸醫(yī)、畜牧、動(dòng)物檢疫、水產(chǎn)養(yǎng)殖等研究領(lǐng)域，成為分子生物學(xué)研究中一項(xiàng)重要的技術(shù)工具。在食品檢測(cè)方面也都有了很大進(jìn)展，包括致病菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢驗(yàn)、食品摻假檢測(cè)等。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概述

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基本原理

PCR(polymerase chain reaction)反應(yīng)技術(shù)即為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的原理在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR，RTQ-PCR)是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)定量方法，它是1996年由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)發(fā)明的，Heid等第一個(gè)發(fā)展了該方法，使用Taqman探針以FAM和TAMRA分別作為熒光報(bào)告染料和淬滅基團(tuán)［1］。RTQ-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的突破，并且具有很多傳統(tǒng)PCR技術(shù)所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，能夠應(yīng)用于基因的定量檢測(cè)，病原體的檢測(cè)，腫瘤基因檢測(cè)，基因的表達(dá)、突變及多態(tài)性分析等多種科學(xué)研究領(lǐng)域［2］。

PCR反應(yīng)由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)和適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期循環(huán)，當(dāng)一個(gè)循環(huán)完成，DNA總量增加一倍，若反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，每次循環(huán)所得的產(chǎn)物都是下一次循環(huán)的模板，從而使模板DNA的拷貝數(shù)呈指數(shù)(2n)快速增加［3］。RTQ-PCR不僅是對(duì)模板DNA進(jìn)行指數(shù)性擴(kuò)增，而且通過(guò)檢測(cè)每次循環(huán)PCR產(chǎn)物的總累積量，得到很好的定量結(jié)果。RTQ-PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記因子，隨著DNA的復(fù)制擴(kuò)增，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，當(dāng)儀器檢測(cè)到熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)，記錄下此時(shí)的循環(huán)數(shù)(即CT值)，同時(shí)儀器自動(dòng)繪制出擴(kuò)增曲線和熔解曲線。利用一系列的數(shù)學(xué)方法對(duì)得到的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行處理分析，達(dá)到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)DNA片段的目的［4］。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分類(lèi)

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的熒光模式不同，RTQ-PCR方法分為熒光染料法和熒光探針?lè)?種。

1.2.1 熒光染料法

熒光染料法是在PCR體系中加入熒光染料，熒光染料能非特異性的結(jié)合到DNA雙鏈的小溝中，通過(guò)熒光信號(hào)的積累監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行，從而對(duì)目的基因進(jìn)行定量［5］。SYBR Green1是應(yīng)用最廣泛的一種熒光染料，僅能與DNA雙鏈結(jié)合，結(jié)合到DNA雙鏈上的SYBR染料能夠發(fā)射熒光信號(hào)，而沒(méi)有結(jié)合的不會(huì)發(fā)射，從而保證了熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步［6］。SYBR Green1法因成本低廉，被普遍應(yīng)用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。此外還有LC Green TM1和Pico Green等新型熒光染料，與SYBR Green1相比，LC Green TM1能夠與dsDNA分子完全結(jié)合，高濃度下不會(huì)抑制PCR反應(yīng)，而且其抗水解、抗熱解和抗光解能力均比 SYBR Green1要強(qiáng)［6］。Pico Green比SYBR Green1的靈敏度較高，具有RNA、ssDNA以及其他物質(zhì)影響小和線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［7］。熒光染料法的主要優(yōu)勢(shì)在于成本低，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，通用性好，不需要設(shè)計(jì)探針，能夠高通量的定量PCR檢測(cè)。但它不能識(shí)別特定的DNA模板，很容易受到引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，所以想要得到好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物的特異性和PCR反應(yīng)的條件要求較高。

1.2.2 熒光探針?lè)?/p>

熒光探針?lè)ㄊ抢媚芘c目的DNA片段特異性雜交的探針，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量指示，由于其特異性高，主要用于專(zhuān)一序列的DNA檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是高適應(yīng)性和可靠性，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果高度穩(wěn)定，但當(dāng)目的基因序列較短時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果不好［8］。根據(jù)熒光基團(tuán)標(biāo)記和共振能量轉(zhuǎn)移的方式，主要分為水解探針和雜交探針，典型的水解探針有 TaqManTM探針和TaqMan MGB探針，雜交探針有雙雜交探針、分子信標(biāo)和熒光標(biāo)記引物/探針等［9］。

最常用的水解型探針是TaqManTM探針，它是一種特異性的寡核苷酸探針，兩端分別標(biāo)記顯色熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，顯色熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅熒光基團(tuán)吸收，隨著PCR反應(yīng)的擴(kuò)增，Taq酶的5，端外切酶活性把探針降解，使得顯色基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離發(fā)出熒光信號(hào)。每擴(kuò)增1條DNA鏈，即可形成1個(gè)熒光信號(hào)［8］。TaqMan MGB探針是根據(jù)TaqMan探針的不足改進(jìn)起來(lái)的，它是將MGB(minor groove binder)分子加在探針的3’端，結(jié)合在雙鏈DNA的小溝部分，采用的是非熒光淬滅基團(tuán)。與TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針更容易配對(duì)，分辨率大大提高(可以分辨出一個(gè)堿基的差異)［10］，具有熒光本底低、淬滅效果好、標(biāo)記更靈活、熒光信號(hào)信噪比提高等明顯優(yōu)勢(shì)。

雙雜交探針是以熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)為基礎(chǔ)，所以又稱(chēng)為FRET探針或Light Cycler探針。它由2條探針組成，一條在5’端標(biāo)記受體熒光基團(tuán)，另一條在3’端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，2條探針首尾相連與同一模板鏈的相鄰序列雜交結(jié)合，供受體基團(tuán)產(chǎn)生FRET現(xiàn)象發(fā)出熒光信號(hào)。在PCR延伸階段，2條探針在Taq聚合酶作用下分開(kāi)，熒光消失，所以雙雜交探針?lè)z測(cè)的不是累積信號(hào)，而是實(shí)時(shí)信號(hào)［11－12］。分子信標(biāo)法是利用一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)式的單鏈DNA作為探針，在自由狀態(tài)下3’端的熒光報(bào)告基團(tuán)和5’端的淬滅基團(tuán)相互靠近，熒光被淬滅。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被逐漸拉開(kāi)，2個(gè)末端分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光［13］。分子信標(biāo)的特點(diǎn)是能夠循環(huán)使用，敏感度高，可識(shí)別出單核苷酸差異的序列，對(duì)檢測(cè)點(diǎn)突變有很好的效果。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用

到目前為止，通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增是食品檢測(cè)中最常用的方法［14］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其特有的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品和農(nóng)畜產(chǎn)品的各個(gè)研究領(lǐng)域，包括對(duì)mRNA表達(dá)分析，食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因食品、菌種分離以及各種食品中動(dòng)物源性檢測(cè)等［12］。

2.1 食源性致病菌檢測(cè)

當(dāng)今食品安全越來(lái)越受到人們的關(guān)注，這已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問(wèn)題，其中由食品致病菌引發(fā)的一系列食源性疾病是最重要的原因之一。傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)方法存在很多弊端已經(jīng)不能滿(mǎn)足現(xiàn)今的食品安全檢測(cè)要求，RTQ-PCR技術(shù)的應(yīng)用為致病菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了一個(gè)很好的技術(shù)方法。

沙門(mén)氏菌是食品中最重要的食源性致病菌之一，資料顯示，無(wú)論是在我國(guó)還是在全球范圍內(nèi)的致病菌食物中毒中沙門(mén)氏菌所占比例都非常大，對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生極大的危害，導(dǎo)致食物中毒、傷害和腸胃炎等多種人類(lèi)疾病［15］。杜雄偉［16］等對(duì)inva基因設(shè)計(jì)引物，利用熒光染料法建立了沙門(mén)氏菌RTQ-PCR檢測(cè)方法，對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)下線到達(dá)101CFU/mL，具有很高的靈敏度，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)肉制品的沙門(mén)氏菌，而且操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。Rodriguez［17］等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來(lái)比較檢測(cè)生豬肉和禽肉、生菜沙拉以及綿羊奶制品中的沙門(mén)氏菌，結(jié)果表明該方法快捷高效，檢出范圍廣，符合ISO標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)用性很強(qiáng)。

金黃色葡萄球菌是引發(fā)食物中毒的另一種常見(jiàn)致病菌，存在于乳、肉、蔬菜等食物中，能夠產(chǎn)生腸毒素等多種毒素，引起人體產(chǎn)生嚴(yán)重感染［18］。Pilla［19］等人建立的雙向?qū)崟r(shí)定量PCR方法來(lái)鑒定金黃色葡萄球菌，通過(guò)對(duì)從90頭乳房炎奶牛中分離的140株菌進(jìn)行測(cè)試，以nuc和Sa442基因?yàn)槟康幕颍Y(jié)合形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，最后通過(guò)基因測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示該方法敏感性和特異性達(dá)到了100%，而且可用于高通量鑒定。又通過(guò)對(duì)40個(gè)牛奶樣品的檢測(cè)，表明此方法能直接對(duì)牛奶樣品進(jìn)行乳房炎乳的鑒定。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)還用于副溶血性弧菌、志賀氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌等致病菌的檢測(cè)，并得到了很好的應(yīng)用［20－21］。

2.2 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)

隨著大量的轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)入市場(chǎng)，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識(shí)、安全性等問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中存在敏感性差、操作繁瑣、假陽(yáng)性等很多缺點(diǎn)，建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的鑒定方法已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱門(mén)課題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為一種新興技術(shù)在分子水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分準(zhǔn)確性更高，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的定性、品系鑒定和含量檢測(cè)［22］。曹際娟［23］等利用轉(zhuǎn)基因小麥外源片段與染色體重組的邊界序列設(shè)計(jì)引物，建立實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系，并用轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、稻米和非轉(zhuǎn)基因小麥作對(duì)照。這種方法的品系鑒定特異性很好，靈敏度可達(dá)到0.01%(m/m)，為檢測(cè)含有相同外源基因的不同轉(zhuǎn)基因小麥品系提供了更為有效的方法，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 食品中動(dòng)植物源性檢測(cè)

近年來(lái)市場(chǎng)上出現(xiàn)了大量食品摻假、摻雜的違法現(xiàn)象，由于受到價(jià)格、加工原料、成本等諸多因素的影響，一些不法生產(chǎn)商使用成本較低的材料來(lái)冒充生產(chǎn)食品，以此獲取高額利潤(rùn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在檢測(cè)食品中的摻雜成分方面被國(guó)內(nèi)外研究者廣泛應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)研究中，建立了食品中動(dòng)植物源性多成分的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法［24－26］。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法多建立在對(duì)物種蛋白質(zhì)的分析上，通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)確定某種源性成分［27］。而鑒定DNA分子除了具有種內(nèi)保守性高、種間特異性強(qiáng)的特點(diǎn)外還有穩(wěn)定性較高的優(yōu)點(diǎn)，可單獨(dú)作為物種判別依據(jù)［28］。

史艷宇［29］等利用鴨線粒體基因全序列作為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針和引物，以牛肉、羊肉、雞肉、豬肉等畜禽肉制品作為參考物種做特異性檢測(cè)，用羊肉DNA(50 mg/kg)溶液對(duì)鴨肉DNA稀釋進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，成功建立檢測(cè)鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，該方法設(shè)計(jì)的引物和探針特異性強(qiáng)，能快速有效檢測(cè)鴨源性成分，且羊肉成分存在對(duì)鴨肉的靈敏度無(wú)影響，靈敏度達(dá)到0.1 μg/kg的較高水平。通過(guò)對(duì)市售加工肉制品中的鴨源性成分檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出加工肉制品中的鴨源性成分，這種方法應(yīng)用范圍廣，為食品的摻假制假檢測(cè)提供了良好的技術(shù)支持。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也應(yīng)用于食品中香蕉成分的檢測(cè)，李富威［30］等根據(jù)香蕉葉綠體rbcL基因序列的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針對(duì)香蕉和55種對(duì)照樣品進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，靈敏度為香蕉DNA 0.000 1 ng/μL，香蕉粉0.001%(m/m)。此外，李楠［31］等人和范麗麗［32］等人還分別實(shí)現(xiàn)了肉制品中馬源性成分和豬源性成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

2.4 mRNA表達(dá)量的研究應(yīng)用

研究mRNA的表達(dá)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)一項(xiàng)非常重要的應(yīng)用［33］。大部分組織細(xì)胞都是先將細(xì)胞核內(nèi)的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后通過(guò)核糖體指導(dǎo)合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，觀察組織細(xì)胞中相應(yīng)mRNA的表達(dá)量是研究組織蛋白的關(guān)鍵，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠在研究中準(zhǔn)確分析基因mRNA的表達(dá)水平。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用熒光定量PCR技術(shù)研究mRNA表達(dá)的報(bào)道有很多，其主要實(shí)驗(yàn)步驟為:先提取樣品中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用設(shè)計(jì)好的引物對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并對(duì)總RNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，接著將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后克隆測(cè)序比對(duì)，并以倍數(shù)梯度稀釋cDNA制作擴(kuò)增效率曲線，最后分析數(shù)據(jù)和討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。黃雅娟［34］等在文章中詳細(xì)說(shuō)明了建立綿羊嫩度相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的熒光定量PCR的檢測(cè)方法。Fan［35］等研究了MYF-6基因在杜洛克豬和皮特蘭豬出生后骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律，使用SYBR熒光染料進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)在腰眼肌中皮特蘭豬MYF-6基因的表達(dá)量高于杜洛克豬，具有重要的意義。李劍虹［36］等使用熒光定量PCR方法研究了AA雞肉PCK1基因的表達(dá)量與冷刺激時(shí)間的關(guān)系，選用相對(duì)定量法處理數(shù)據(jù)，詳細(xì)探討了隨著冷刺激處理時(shí)間的不同，PCK1基因在AA肉雞肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和胸腺等不同組織部位的表達(dá)變化及原因。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)展望

雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在不足之處，如實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，試劑材料價(jià)格昂貴，不能實(shí)時(shí)檢驗(yàn)出PCR產(chǎn)物的大小，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法繁瑣等。隨著技術(shù)的發(fā)展，RTQ-PCR技術(shù)也會(huì)不斷得到改進(jìn)和完善，尤其是與基因芯片、高通量測(cè)序等其他生物技術(shù)相結(jié)合，其諸多優(yōu)點(diǎn)會(huì)顯示出更強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越多的科學(xué)研究者接受。在未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品質(zhì)量控制領(lǐng)域會(huì)是一種非常好的工具，在食品安全檢測(cè)的很多方面也會(huì)成為一種新的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

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