李銀鵬　石芳　楊婧　劉政

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油中心醫(yī)院呼吸科

肺癌患者血清和胸水中Dickkopf-1的表達(dá)及臨床意義

李銀鵬石芳楊婧劉政

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油中心醫(yī)院呼吸科

【摘要】目的探討肺癌患者血清以及胸水中Dickkopf-1(DKK-1)的表達(dá)，以及其在臨床應(yīng)用中的診斷價值。

方法選取2011年3月至2012年4月呼吸科肺癌82例，良性病變者38例。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測肺癌以及肺部良性病變患者血清以及胸水中DKK-1的濃度，比較肺癌與肺部良性病變患者血清以及胸水中DKK-1的表達(dá)情況。結(jié)果肺癌患者血清以及胸水中DKK-1的含量均較肺部良性病變患者顯著增高(P＜0.05)。血清中與胸水中DKK-1的表達(dá)正相關(guān)(r =0.72，P＜0.05)。血清以及胸水中DKK-1用于診斷肺癌以及肺癌骨轉(zhuǎn)移的敏感性及特異性均較高。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者予以正規(guī)化療2個療程后患者血清中DKK-1表達(dá)降低(P＜0.05)。結(jié)論DKK-1有望成為肺癌以及肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷與治療新的靶點。

【關(guān)鍵詞】DKK-1;肺腫瘤;酶聯(lián)免疫吸附法;骨轉(zhuǎn)移

E-mail: keaiduo68@163.com

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率在世界范圍內(nèi)占腫瘤性疾病的第一位［1］，雖然近年來肺癌的早期診斷以及治療方面取得了一些進(jìn)展，但肺癌的總體預(yù)后仍然很差，其5年生存率總體不超過15%［2］。因此尋找理想的肺癌診斷、治療、預(yù)后的指標(biāo)具有重要的臨床意義。Dickkopf-1(DKK-1)為一種分泌型糖蛋白，有研究表明DKK-1在肺癌患者的血清中高表達(dá)，有望成為肺癌診斷以及評價預(yù)后的新的血清學(xué)指標(biāo)［3］，本研究通過檢測肺癌患者血清以及胸水中DKK-1的表達(dá)探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2011年3月至2012年4月在我院呼吸科住院患者120例，其中男78例，女42例;平均年齡(63±12)歲。肺癌患者82例，良性病變患者38例。肺癌患者均經(jīng)病理證實，腺癌37例，小細(xì)胞肺癌21例，鱗癌24例;伴有胸膜轉(zhuǎn)移引起胸水28例，伴有骨轉(zhuǎn)移31例?；颊呔鶠槌踉\患者且未經(jīng)過放化療，并排除合并有其他惡性腫瘤。肺癌的分期按美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥分期(TNM)手冊(2009，第7版)制定的原則［3］，Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期47例。對照組為同期住院良性病變患者38例，包括肺部感染15例，肺結(jié)核8例，結(jié)核性胸膜炎15例伴有胸水。

1.2檢測方法患者入院第2天清晨抽取靜脈血5 ml，室溫下放置30 min，1 500 r/min，離心10 min，取上清液放入－70℃冰箱保存，待測。胸腔積液患者入院后行胸腔穿刺時收集胸腔積液15 ml，同時次日清晨抽取靜脈血，同樣按照上述方法處理標(biāo)本，待測。試劑及儀器:人DKK-1ELISA檢測試劑盒購蘇州科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司(美國RayBiotech生物公司生產(chǎn))，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀購自美國Biorad公司。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，各組之間DKK-1濃度的比較采用獨立樣本t檢驗，化療前后采用血清中DKK-1濃度的比較采用配對t檢驗，腫瘤各種類型以及分期之間DKK-1濃度的比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組患者血清中DKK-1濃度肺癌患者血清DKK-1濃度為(36±17)ng/ml，明顯高于肺部良性病變患者(11±7)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而在肺部良性病變中肺部感染(9±6)ng/ml與肺結(jié)核(14±9)ng/ml患者血清DKK-1的濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.22組患者胸水中DKK-1濃度肺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移引起胸水以及結(jié)核性胸膜炎患者胸水中DKK-1濃度分別為(31±17)ng/ml和(14±7)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而在肺癌伴有胸水的患者中肺腺癌(28±12)ng/ml，小細(xì)胞肺癌(36±21)ng/ml，鱗癌(19±5)ng/ml之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。43例(肺癌28例，結(jié)核性胸膜炎15例)患者同時收集外周血及胸水的DKK-1濃度分別為(27 ±17)ng/ml VS(34±20)ng/ml，通過雙變量相關(guān)分析二者呈正相關(guān)(r =0.72，P＜0.05)。見圖1。

圖1　肺癌患者血清以及胸腔積液中DKK－1濃度的相關(guān)性

2.3血清及胸水中DKK-1對肺癌的診斷價值應(yīng)用ROC曲線計算血清中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為19.22 ng/ml，其敏感度為83.3%，特異度為82.1%，其曲線下面積為0.931，同樣胸水中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為15.42 ng/ml，其敏感度為87.9%，特異度為70%，其曲線下面積為0.832，見圖2。

圖2　血清以及胸水中DKK－1診斷肺癌的ROC曲線

2.4血清中DKK-1濃度對肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價值31例肺癌伴有骨轉(zhuǎn)移患者DKK-1濃度較無骨轉(zhuǎn)移者顯著升高，進(jìn)一步通過ROC曲線計算肺癌骨轉(zhuǎn)移血清中DKK-1診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的最佳臨界值為36.76 ng/ml，其敏感度為80.6%，特異度為78.4%，曲線下面積為0.843。見圖3。

圖3　血清中DKK－1濃度診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移ROC曲線

2.5化療前后血清DKK-1濃度的變化15例Ⅳ期肺癌患者分別于第1次及第3次化療前抽取靜脈血檢測其DKK-1的濃度化療后(32±18)ng/ml較化療前(48 ±21)ng/ml血清中DKK-1濃度明顯降低(P＜0.01)。

2.6DKK-1濃度與肺癌臨床特征之間的關(guān)系肺癌患者中不同性別，吸煙狀況患者之間DKK-1濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而在組織學(xué)類型中鱗癌與小細(xì)胞肺癌患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其余各種腫瘤之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在不同腫瘤分期，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及有無骨轉(zhuǎn)移的患者中DKK-1濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

3　討論

DKK-1為Wnt傳到通路拮抗劑，為一種分泌型糖蛋白，其通過與Wnt蛋白競爭結(jié)合LRP5/6受體而直接抑制Wnt蛋白活性，進(jìn)而來調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、

表1　DKK-1濃度與肺癌臨床特征　±s

表1　DKK-1濃度與肺癌臨床特征　±s

項目　DKK-1(ng/ml)　P值性別男(n =55)　38±19?。?.05 女(n =27)　36±17吸煙無(n =32)　36±17?。?.05 有(n =50)　40±20組織學(xué)類型腺癌(n =37)　38±19?。?.05小細(xì)胞肺癌(n =21)　44±20　＜0.05鱗癌(n =24)　31±12分期Ⅰ～Ⅱ(n =32)　28±12?。?.05Ⅲ～Ⅳ(n =50)　44±18淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(n =45)　29±14　＜0.05 有(n =37)　47±17骨轉(zhuǎn)移無(n =51)　29±18?。?.05 有(n =31)51±17

遷移或癌變等特性，在腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮重要作用［4，5］，有大量的研究表明，DKK-1在肺癌患者血清以及肺癌標(biāo)本中高表達(dá)［6］，其在肺癌患者血清以及標(biāo)本中的異常表達(dá)可能為肺癌的早期診斷、治療及其預(yù)后提供了新的理論基礎(chǔ)。同樣本研究通過檢測肺癌患者血清及胸水中DKK-1的濃度提示，在肺癌患者血清中DKK-1高表達(dá)，且在晚期、伴有淋巴結(jié)及骨轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)更高。且予以正規(guī)化療后DKK-1濃度降低，同樣在胸水中較結(jié)核性胸膜炎患者肺癌伴有胸腔積液的患者DKK-1濃度更高。同時血清及胸水中DKK-1的濃度檢測對肺癌的診斷的敏感性及特異性均較高。

本研究通過ELISA檢測82例肺癌患者血清中DKK-1濃度，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清DKK-1濃度為(36± 17)ng/ml，明顯高于肺部良性病變患者的(11±7)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，研究結(jié)果與Sheng等［7］通過免疫熒光測量法檢測592例惡性腫瘤患者、72例良性肺部疾病患者及120名健康患者血清中DKK-1的提示肺癌患者血清的DKK-1濃度顯著高于肺部良性病變患者的結(jié)果一致，同時Sheng等［7］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)血清DKK-1的含量與腫瘤的組織分型及患者的年齡和性別無關(guān)，而與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

而本研究發(fā)現(xiàn)性別以及吸煙與否對DKK-1的濃度無影響，同樣肺癌晚期(Ⅲ～Ⅳ)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中其DKK-1濃度顯著高于肺癌Ⅰ～Ⅱ期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。在腫瘤的分型中本研究發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患者血清中DKK-1含量高于肺鱗癌此研究結(jié)果與Yamabuki等［6，7］的研究提示DKK-1含量與肺癌組織學(xué)類型無關(guān)的結(jié)果不一致，考慮可能是本研究肺癌患者病例數(shù)相對較少有關(guān)。

大部分肺癌患者在第1次診斷的時候，37%的患者有局部進(jìn)展，38%的人有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8］，30%～65%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者將有骨轉(zhuǎn)移［9］，骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致一些致死性的并發(fā)癥，即所謂的骨相關(guān)事件(SREs)［10］括疼痛、病理性骨折、神經(jīng)根壓迫、脊髓壓迫、高鈣血癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此對于肺癌骨轉(zhuǎn)移的早期診斷以及及時有效的治療，對于臨床醫(yī)生是極其重要的而Wnt通路的規(guī)范途徑是骨誘導(dǎo)性傳導(dǎo)通路，Wnt通路的信號傳導(dǎo)在整個成骨細(xì)胞分化過程中扮演著重要的角色。DKK-1是一種分泌蛋白，是wnt通路規(guī)范途徑的抑制因子。Lee等［11］報道DKK-1在骨肉瘤組織中高表達(dá)，Tian等［12］發(fā)現(xiàn)DKK-1表達(dá)在

有溶骨損傷的多發(fā)性骨髓瘤組織中，Hall等［13］對前列腺癌患者血清DKK-l蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在骨轉(zhuǎn)移前，血清DKK-1蛋白水平升高;在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的患者中，DKK-1蛋白表達(dá)水平的高低與患者生存期負(fù)相關(guān)。但國內(nèi)外關(guān)于DKK-1在肺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)情況未見相關(guān)報道，本研究根據(jù)患者入院后骨ECT檢查結(jié)果以及患者臨床表現(xiàn)確診為肺癌骨轉(zhuǎn)移患者31例其血清中DKK-1濃度為(51±17)ng/ml較無轉(zhuǎn)移51例患者(29±18)ng/ml顯著增高，進(jìn)一步通過ROC曲線計算出在臨界點為36.76 ng/ml，其診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移敏感度為80.6%，特異度為78.4%，其曲線下面積為0.843，因此可以推測通過檢測血清中DKK-1的濃度用于肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷具有重要的臨床意義。

大部分肺癌患者在出診的時候已經(jīng)處于晚期，因此目前對于肺癌的主要治療手段為化療以及靶向治療［14］，Yamabuki等［6］學(xué)者通過免疫組織化學(xué)的方法檢測279例非小細(xì)胞肺癌患者細(xì)胞內(nèi)DKK-1的含量，進(jìn)行生存分析，結(jié)果提示DKK-1的表達(dá)高低與患者的生存負(fù)相關(guān)，但肺癌患者在化療前后血清中DKK-1含量的如何變化，目前研究甚少，本研究首先通過檢測肺癌患者第1次及第3次化療前血清中DKK-1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)化療后其濃度為(32±18)ng/ml較化療前(48 ±21)ng/ml顯著降低(P＜0.01)，同時本研究通過體外的細(xì)胞實驗同樣得出在順鉑作用前后肺癌細(xì)胞株其細(xì)胞上清中DKK-1表達(dá)減少故推測化療后患者DKK-1濃度的降低可能對患者的預(yù)后有積極的意義，同時Yamabuki等［6］進(jìn)一步研究DKK-1可促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力，盡管其通過與LRP5/6受體而直接抑制Wnt通路，理論上講應(yīng)該是抑制腫瘤，但DKK-1可能與細(xì)胞表面其他未知的分子結(jié)合，而發(fā)揮其侵襲能力。

胸腔積液是肺部多種疾病的并發(fā)癥，大約20%的胸腔積液是惡性腫瘤引起的，其中的50%是原發(fā)性肺癌［15］。同時大約20%的肺癌患者最初的臨床表現(xiàn)為胸腔積液，目前胸水找脫落癌細(xì)胞可作為肺癌伴有胸腔轉(zhuǎn)移以及診斷肺癌的標(biāo)準(zhǔn)，但是由于癌細(xì)胞在積液中午組織及器官結(jié)構(gòu)的束縛經(jīng)過不停地繁殖失去了原來的細(xì)胞形態(tài)，加上胸水中本身存在大量的淋巴細(xì)胞以及間皮細(xì)胞，因此胸水診斷肺癌的細(xì)胞學(xué)檢查敏感性很低［16］，目前在臨床上最常見用于診斷惡性胸腔積液的為CEA［17］，但其單獨用于診斷肺癌其結(jié)果仍不能令人滿意，本研究首先檢測肺癌血清中DKK-1的濃度，同時檢測28例肺癌伴有胸腔積液的患者以及結(jié)核性胸膜炎的患者發(fā)現(xiàn)，肺癌伴有胸腔積液其胸水中DKK-1濃度為(31±17)ng/ml較結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中DKK-1(14±7)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同時通過ROC曲線計算得出胸水中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為15.42 ng/ml，其敏感度為87.9%，特異度為70%，進(jìn)一步通過雙變量相關(guān)分析得出血清中與胸水中DKK-1的濃度正相關(guān)(r =0.72，P＜0.05)，因此可以得出DKK-1在肺癌伴胸腔積液的診斷中具有重要的臨床意義，且檢測方法簡單易行容易被患者接受，因此DKK-1可能成為肺癌的診斷甚至靶向治療的新的熱點。

綜上所述，通過肺癌患者血清以及胸腔積液中DKK-1通過ELISA檢測較肺部良性病變患者顯著增高，且血清以及胸腔積液中DKK-1用于診斷肺癌的敏感性及特異性均較高，肺癌伴有骨轉(zhuǎn)移患者血清中DKK-1含量較無骨轉(zhuǎn)移者顯著升高，且血清中DKK-1用于診斷骨轉(zhuǎn)移其敏感性及特異性好，因此DKK-1有望成為肺癌診斷甚至治療的新靶點。

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Expression and clinical significance of DKK-1 in serum and hydrothorax of patients with lung cancer

LI Yinpeng，SHIFang，YANG Jing，et al.
Department of Respiratory Diseases，Petroleum Clinical Medical Collage of Hebei Medical University，Hebei，Langfang 065000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels of Dickkopf-1(DKK-1)in serum and hydrothorax of patients with lung cancer，and to explore its clinical diagnostic value.MethodsEighty－two patients with lung cancer (observation group)and 38 patients with pulmonary benign lesion (control group)who were admitted into department of respiratory disease of our hospital from March 2011 to April 2012 were enrolled in the study.The levels of DKK-1 in serum and hydrothorax were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for both groups.Results The levels of DKK-1 in observation group were significantly increased，as compared with those in control group (P＜0.05).The expression levels of DKK-1 in serum were positively correlated to those in hydrothorax (r =0.72，P＜0.05).Both sensitivity and specificity of DKK-1 in diagnosis of lung cancer were higher.The levels of DKK-1 were obviously decreased in patients with NSCLC after two treatment courses by routine chemotherapy (P＜0.05).ConclusionDKK-1 is hopeful to become an new target point for diagnosis and treatment of lung cancer

【Key words】DKK-1; lung neoplasms; enzyme-linked immunosorbent assay; bone metastasis

(收稿日期:2014－10－20)

通訊作者:劉政，065000河北省廊坊市，中國石油中心醫(yī)院呼吸科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.004

【文章編號】1002－7386(2015)06－0815－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 734.2