閆澤晨，代醒，楊錦建，張俊杰，郭飛，余捷凱，鄭樹，王家祥(鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南省泌尿外科研究所，鄭州45005； 鄭州大學第五附屬醫(yī)院；浙江大學第二醫(yī)院腫瘤研究所)

兒童雙側(cè)腎母細胞瘤差異性表達蛋白的篩選

閆澤晨1，代醒2，楊錦建1，張俊杰1，郭飛1，余捷凱3，鄭樹3，王家祥1(1鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南省泌尿外科研究所，鄭州450052；2 鄭州大學第五附屬醫(yī)院；3浙江大學第二醫(yī)院腫瘤研究所)

摘要：目的采用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)篩選雙側(cè)腎母細胞瘤(BWT)的差異性表達蛋白。方法選取BWT患兒血清標本10例(BWT組)，另選單側(cè)腎母細胞瘤(UWT)患兒血清標本(UWT組)及健康兒童血清標本(對照組)各20例，采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測并收集相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果 應用生物信息學方法對所得數(shù)據(jù)進行分析，得到差異性峰10個(P<0.01)。對比各組差異性表達蛋白峰值數(shù)據(jù)，篩選出質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)為5 648 Da的差異性表達蛋白1個，其在BWT組、UWT組及對照組中表達強度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三組相比，P均<0.01。 結(jié)論 采用SELDI-TOF-MS技術(shù)成功篩選出一種BWT差異性表達蛋白，其有望成為BWT早期診斷及預后判斷的新的標志物。

關(guān)鍵詞：生物學標記；腎母細胞瘤；蛋白質(zhì)組

腎母細胞瘤(WT)是兒童最為常見的一種原發(fā)性腹部實體器官惡性腫瘤，在中國發(fā)病率為2.5/100萬。該病早期癥狀多無特異性，往往表現(xiàn)為可觸及的無癥狀腹部腫塊。其中，雙側(cè)腎母細胞瘤(BWT)發(fā)病率占所有WT的5%～7%，且5年生存率遠低于單側(cè)腎母細胞瘤(UWT)患者。但目前尚無用于BWT診斷的腫瘤標志物。蛋白質(zhì)指紋技術(shù)又稱表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，能對不同組別生物樣本的相關(guān)性蛋白質(zhì)標志物表達情況進行篩選，為尋找與BWT相關(guān)的腫瘤標志物提供了可能[1,2]。2009年1月～2013年12月，我們分別采集了BWT患兒、UWT患兒及健康兒童的血清樣本，并采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對BWT差異性表達蛋白進行篩選[3]，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1血清樣本收集與處理于清晨空腹狀態(tài)下分別采集10例BWT患兒(BWT組)、20例UWT患兒(UWT組)和20例健康兒童(對照組)的血清樣本。BWT組男3例，女2例，年齡7～48個月，平均(34.20±12.41)個月，均經(jīng)病理證實為BWT。UWT組男6例，女4例，年齡4～56個月，平均(41.20±10.12)個月，均經(jīng)病理證實為UWT。對照組男5例，女5例，年齡4～74個月，平均(34.53±15.52)月。三組性別、年齡具有可比性。同時，根據(jù)WT的分期標準，所選取的BWT均為Ⅴ期，UWT為Ⅰ～Ⅳ期。所采集的血清樣本于室溫靜置1～2 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，分裝于EP管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2試劑與儀器尿素(Urea)，醋酸鈉(NaNC)，1,4-二硫蘇糖醇(DTT)，甲基氰(ACN)，3-環(huán)已胺-1-丙磺酸(CHAPS)，三氟乙酸(TFA )及芥子酸(SPA)等購于Sigma公司。精密電子天平(AT261)購于Mettler公司。去離子純水機(Milli-Q Plus)購于Millipore公司。雪花制冰機(YB-ZBJ-X40)購于Ross Temp公司。冷凍高速離心機(Sorvall Stratos)、-80 ℃超低溫冰箱及微量移液器等購自Thermo公司。PBSⅡ+型SELDI-TOF-MS分析儀及弱陽離子交換芯片(WCX2)等購自Ciphergen Biosystem公司。

1.3差異性表達蛋白的篩選三組血清在冰浴上緩慢融解(30～60 min)，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，取5 μL血清，加入10 μL U9血清處理液中，4 ℃條件下?lián)u床上振蕩使其充分混合(600次/min，共振蕩30 min)；用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200 μL，4 ℃搖床上振蕩(600次/min，振蕩2 min)后于WCX2蛋白芯片上樣。先用已知分子量的標準蛋白芯片All-in-One將SELDI質(zhì)譜系統(tǒng)的分子量誤差校正至<0.1%，再將待測芯片放入質(zhì)譜儀中檢測[4,5]。

1.4數(shù)據(jù)分析應用Ciphergen Biosystems 3.1對所采集數(shù)據(jù)進行校正，使總離子強度與分子量均一化。用非抽樣離散小波轉(zhuǎn)換法對原始數(shù)據(jù)進行整理并作信號降噪處理。根據(jù)標記好的出現(xiàn)在所有選定光譜中的3個峰值，調(diào)整信號強度標記。采用對齊單調(diào)的最小曲線和質(zhì)量校正的方法對光譜進行基線校正。過濾信噪比(S/N)>2的峰值。聚類分析的最小閾值設定為10%，并將各個樣本中質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)差異<0.3%的峰值聚為同一類[6]。對找出的峰值在各個樣本中的強度作均一化處理。將集內(nèi)最大高度作為降值，代表蛋白表達強度。

1.5統(tǒng)計學方法將數(shù)據(jù)進行過濾噪音及聚類分析處理后，對篩選出的m/z峰值進行Wilcoxon秩和檢驗，各組數(shù)據(jù)兩兩比較采用進行t檢驗。檢驗標準α=0．01。

2結(jié)果

經(jīng)SELDI-TOF-MS技術(shù)對各組血清樣本進行篩選，得到一系列蛋白質(zhì)表達強度數(shù)據(jù)。再將BWT組、UWT組及對照組的數(shù)據(jù)進行Wilcoxon秩和檢驗，篩選出差異性表達蛋白m/z的峰值。其中，BWT組與對照組中篩選出差異性蛋白峰值14個，其中8個在BWT組中高表達，4個在對照組中高表達；BWT組與UWT組篩選出差異性蛋白峰值10個，其中8個在BWT組中高表達，2個在UWT組中高表達；UWT組與對照組中篩選出差異性蛋白峰值13個，其中11個在BWT組中高表達，2個在對照組中高表達。對比各組差異性表達蛋白峰值數(shù)據(jù)，篩選出一種m/z 為5 648 Da的蛋白，其在BWT組、UWT組及對照組中的表達強度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三組相比，P均<0.01。

3討論

WT又稱為腎胚胎瘤，多發(fā)于兒童，50%的患兒于5歲前發(fā)病。該病早期無明顯癥狀，多為父母為患兒洗澡或穿衣時被發(fā)現(xiàn)。BWT極為少見，其診斷與治療均較UWT復雜。根據(jù)兒童腫瘤組織基于外科和組織病理學制定的WT分期標準，BWT屬于Ⅴ期，其預后相對較差。雖然近年來超聲、CT及MRI等影像學檢查技術(shù)不斷發(fā)展成熟，BWT的檢出率也越來越高，然而對于一側(cè)腫瘤直徑<1.0 cm的BWT仍有一定的漏診率[7]。BWT患兒早期確診后行術(shù)前化療有利于腫瘤切除，并可減少術(shù)中腫瘤破潰率及術(shù)后并發(fā)癥。但目前針對BWT尚無一種高特異性的腫瘤標志物。因此，篩查BWT差異性表達蛋白對于提高BWT早期確診率、減少漏診及預后判斷非常重要[8]。

蛋白質(zhì)組學的概念由澳大利亞學者Marc Wilkins于1994年率先提出，指基因組表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。蛋白質(zhì)組學方法旨在蛋白質(zhì)水平上對細胞或機體基因表達的終產(chǎn)物進行定性及定量研究，從而揭示生命活動規(guī)律及基因表達調(diào)控機制[9]。SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合了芯片微陣列與質(zhì)譜技術(shù)兩者的優(yōu)點，其將傳統(tǒng)基質(zhì)改為以色譜原理設計的蛋白質(zhì)芯片，增強了其分離能力；芯片表面利用親和力來捕獲蛋白質(zhì)的分子量、等電點、磷酸化位點及糖基化位點等信息[2]；利用激光脈沖輻射解吸芯片中的待測樣本，形成荷電離子，后根據(jù)不同的質(zhì)荷比及離子在儀器場中飛行時間不同來繪制質(zhì)譜圖，能檢測出樣品中各種蛋白質(zhì)的分子量及表達水平。近年來，SELDI-TOF-MS技術(shù)已廣泛應用于腫瘤、心腦血管疾病及免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病的研究，同時也被認為是腫瘤早期標志物檢測方面最有發(fā)展前景的一項技術(shù)[10]。該技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展為我們尋找WT，尤其是BWT的差異性表達蛋白提供了新的思路與方法。

我們采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對BWT組、UWT組及對照組血清蛋白進行篩選，得到m/z 為5 648 Da的差異性表達蛋白在BWT組、UWT組及對照組中的蛋白表達強度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65及432.21±730.42，三組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義。目前認為，組織病理學特征與分期是影響WT患兒預后的最主要因素。本研究中BWT患兒均屬于Ⅴ期，而UWT患兒為Ⅰ～Ⅳ期。BWT組m/z 為5 648 Da的蛋白表達強度明顯高于UWT組，與腫瘤分期有一定聯(lián)系。且UWT組、BWT組m/z 為5 648 Da的蛋白表達強度均高于對照組，這說明該差異性表達蛋白在WT，尤其是BWT的生長與分化中可能起到一定的作用，有助于BWT的診斷及預后評估。

總之，本研究成功篩選出了一種在BWT與UWT、健康兒童之間差異性表達的蛋白，為后續(xù)差異性表達蛋白的鑒定及BWT的靶向治療等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，同時其有望成為早期診斷BWT及判斷預后的新的標志物[11,12]。然而由于BWT發(fā)病率低，本研究納入樣本量相對較少，故該差異性表達蛋白的可靠性有待于進一步驗證。

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Screening of proteins associated with pediatric bilateral wilms tumor

YANZe-chen1, DAI Xing, YANG Jin-jian, ZHANG Jun-jie, GUO Fei, YU Jie-kai,

ZHENGShu,WANGJia-xiang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Abstract:ObjectiveTo select the differentially expressed proteins of bilateral wilms tumor (BWT) by using SELDI-TOF-MS technology. MethodsA total of 10 serum samples of children with BWT(BWT group), 20 serum samples of children with Unilateral Wilms Tumor (UWT group) and 20 serum samples of healthy children(control group) were selected. SELDI-TOF-MS technology was used to detect the differentially expressed BWT proteins. ResultsTen difference BWT proteins peaks were found(P<0.01). The highest Youden′s index was obtained to select one differentially expressed protein with m/z of 5 648 Da. The selected expression BWT protein in BWT group, UWT group and control group was 3 889.36±1 796.83, 2 886.81±1 404.65 and 432.21±730.42, respectively(all P<0.01). ConclusionA differentially expressed protein of BWT group was successfully obtained by using SELDI-TOF-MS technology, which is expected to be a new marker for the early diagnosis and prognosis of BWT.

Key words:bological markers; nephroblastoma; proteomics

(收稿日期：2014-11-28)

通信作者簡介：王家祥(1958-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向為腹部實體腫瘤的蛋白組學研究及小兒外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail:wjxzzu@126.com

作者簡介：第一閆澤晨(1988-)，男，博士，研究方向為腹部實體腫瘤的蛋白組學研究及泌尿外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：yanzechen@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81172085/H1608)。

中圖分類號：TQ937；R737.11

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.003