戚勛，苑永輝，鐘紅珊，徐克(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧省影像診斷與介入治療重點實驗室，沈陽000;遼寧省腫瘤醫(yī)院)

2-羥丙基-β-環(huán)糊精對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的影響

戚勛1，苑永輝2，鐘紅珊1，徐克1
(1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧省影像診斷與介入治療重點實驗室，沈陽110001;2遼寧省腫瘤醫(yī)院)

摘要:目的探討2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)體外增殖和遷移的作用。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為兩組，實驗組分別加入濃度為10(－10)、10(－9)、10(－8)、10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L的2HP-β-CD，空白組加入含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖活力，改良Boyden Chamber法檢測各組細胞的遷移能力。結(jié)果實驗組中，加入10(－10)、10(－9)、10(－8)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)分別為空白組的1.4、1.6、1.7倍，10(－8)mol/L 2HP-β-CD增強細胞增殖活力的作用最明顯(P均＜0.01) ;加入10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義。加入10(－9)及10(－8)mol/L 2HP-β-CD者細胞遷移數(shù)顯著高于空白組(P均＜0.05)，其他濃度組細胞遷移數(shù)與空白組比較差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論適當濃度的2HP-β-CD可促進HUVEC的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞:2-羥丙基-β-環(huán)糊精;臍靜脈內(nèi)皮細胞;細胞遷移;細胞增殖;血管新生

治療性血管新生是指將外源性血管新生誘導因子轉(zhuǎn)入組織中，促進缺血區(qū)側(cè)支毛細血管新生［1］，是近年來治療局部缺血性疾病的重要方法［2］。血管新生過程與血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖密切相關(guān)［3］。環(huán)糊精(CD)是一類環(huán)狀低聚糖，研究顯示，β-CD可以刺激兔角膜血管新生［4］，而高濃度硫酸-β-環(huán)糊精具有抑制血管新生的作用［5］。關(guān)于2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)對血管新生作用的報道少見。2014年6～12月，我們觀察了2HP-β-CD對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖和遷移的作用，旨在為治療性血管新生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料HUVEC購于南京凱基生物，解凍復蘇后加入含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待細胞融合至80%～90%狀態(tài)后用于實驗。2HP-β-CD、牛血清白蛋白、纖粘連蛋白、PBS及RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma-Aldrich公司，細胞增殖-毒性檢測試劑盒購于日本Dojindo公司，青、鏈霉素和胰蛋白酶購于南京凱基生物，Diff-Quick染液購于北京Propbs公司，Boyden Chamber 及8 μm PVPF聚碳酸膜購于Neuroprobe。

1.2細胞增殖活力檢測采用CCK-8法。取HUVEC細胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成細胞懸液。按每孔1 500個接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入含0.5% FBS的培養(yǎng)液預處理24 h，以達到細胞同步化。細胞分為實驗組和空白組，實驗組又分為6個濃度亞組，分別為N－10、N－9、N－8、N－7、N－6、N－5組，分別加入濃度為10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L的2HP-β-CD，每組設(shè)6個復孔，按100 μL/孔加入含藥培養(yǎng)液，空白組加入含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。使用酶標儀測波長450 nm處的OD值。

1.3細胞遷移能力檢測采用改良Boyden Chamber法。將8 μm PVPF聚碳酸膜經(jīng)10 μg/mL纖粘連蛋白浸泡4℃過夜，使用前1 h晾干。按1.2的方法進行細胞分組。分別于下室每孔加入濃度為10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L 2HP-β-CD 36 μL及含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液，另取含0.5% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基、血清饑餓24 h的HUVEC細胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成含0.25% BSA 的RPMI1640細胞懸液，分別于上室每孔加入含細胞2.5×105/mL的細胞懸液200 μL。上、下室之間隔以8 μm PVPF聚碳酸膜，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育5 h。取出濾膜，Diff-Quick染液試劑盒固定、染色，取10個高倍視野計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法使用PRISM6.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以珋x±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本間比較采用單向方差分析Dunnet-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

N－10、N－9、N－8組細胞增殖活力較空白組顯著增強(P均＜0.01) ; N－10、N－9、N－8組細胞增殖活力與2HP-β-CD濃度呈劑量依賴性(P＜0.05)。N－7、N－6、N－5組細胞增殖活力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)。與空白組比較，N－9、N－8組內(nèi)皮細胞遷移數(shù)明顯增加(P均＜0.05)，其余濃度組與空白組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)。

表1　各組細胞增殖活力與遷移能力比較(n=6，±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　細胞增殖活力(OD450)　細胞遷移數(shù)(個)實驗組N－10　2.82±0.17＊＊　40.67±2.91 N－9　3.18±0.15＊＊　112.17±29.27*N－8　3.34±0.13＊＊　116.67±21.92*N－7　2.39±0.19　78.67±18.26 N－6　2.57±0.24　86.33±8.17 N－5　2.17±0.07　40.41±4.66空白組2.04±0.20　49.60±4.55

3　討論

完整的單層血管內(nèi)皮細胞系統(tǒng)是血管壁發(fā)揮正常功能的必要條件，血管損傷可導致內(nèi)皮功能喪失或失去完整性，引起動脈粥樣硬化和血管再狹窄，因此促進和恢復內(nèi)皮細胞完整性具有重要意義。血管新生是一個新的微血管發(fā)展成一個血流供應(yīng)系統(tǒng)的過程。在血管新生過程中，首要步驟是內(nèi)皮細胞在趨化因子的作用下發(fā)生遷移、增殖［6］。要達到治療性血管新生的目的，血管新生誘導因子必須作用于微血管內(nèi)皮細胞的特異性受體，引起微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，形成毛細血管樣管腔結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過血管的重構(gòu)形成新的毛細血管網(wǎng)［7，8］。

CD是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，具有親水的外圍和疏水的核心，其核心具有分子識別作用，可以選擇性包絡(luò)特定物質(zhì)。CD通常含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元，其中研究較多的是含有6、7、8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α-CD、β-CD和γ-CD［9］。研究表明，與CD同屬于多糖的葡萄糖胺聚糖可以通過激活血管新生相關(guān)的生長因子受體來調(diào)節(jié)血管新生生長因子的活性，從而對血管內(nèi)皮細胞有一定的作用。Folkman等［4］報道，β-CD可以刺激兔角膜血管新生達正常組的303%，對照組則為正常組的164%。

本研究顯示，體外環(huán)境下，2HP-β-CD能夠明顯促進HUVECs的增殖和遷移。Bachinsky等［10］報道，β-CD是一種肝素類似物，可產(chǎn)生高密度負電荷，通過與染料和肝素結(jié)合性表皮生長因子(即成纖維細胞生長因子)等陽離子型分子結(jié)合而產(chǎn)生一定的生物學效應(yīng)。本研究中，10－10、10－9、10－8mol/L的2HP-β-CD能夠劑量依賴性地增加內(nèi)皮細胞增殖活力，10－9和10－8mol/L的2HP-β-CD可顯著促進內(nèi)皮細胞遷移，可能是由于β-CD與肝素結(jié)合性表皮生長因子結(jié)合后形成復合物后，使肝素結(jié)合性表皮生長因子具有一定的緩釋作用，從而穩(wěn)定、持續(xù)地發(fā)揮生物學作用，目前已知肝素結(jié)合性表皮生長因子具有促進包括血管內(nèi)皮細胞、間葉細胞和神經(jīng)外胚層在內(nèi)的一系列細胞增殖的作用，因此適當濃度的2HP-β-CD可能是通過上述機制促進HUVEC的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，高濃度的2HP-β-CD未能促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，推測其原因可能與過高濃度的2HP-β-CD產(chǎn)生過多的高密度負電荷，與肝素結(jié)合性表皮生長因子結(jié)合形成復合物后，難以釋放出肝素結(jié)合性表皮生長因子，從而影響肝素結(jié)合性表皮生長因子與其受體的結(jié)合有關(guān)。

綜上所述，2HP-β-CD能夠明顯促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，推測其在缺血性疾病血管新生的發(fā)生和發(fā)展中具有一定作用，有利于缺血部位側(cè)支循環(huán)的形成。其作用機制仍需進一步證實。

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Effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin on migration and proliferation of HUVECs

QI Xun1，YUAN Yong-hui，ZHONG Hong-shan，XU Ke
(1 The First Affiliated Hospital of China Medical University，Key Laboratory of Diagnostic Imaging and Interventional Radiology of Liaoning Province，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2HP-β-CD) on the migration and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro.Methods HUVECs were cultured in vitro and were divided into two groups: the experimental group and the blank group.HUVECs in the experimental group were treated with different concentrations of 2HP-β-CD (10(－10)-10(－5)mol/L)，and the same amount of 0.5% FBS was added into the blank group.CCK-8 was used to detect the cell proliferation activities of the two groups，and the modified Boyden Chamber was applied to observe the cell migration in each group.Results The OD(450)of the experimental group which was added with 10(－10)mol/L，10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L 2HP-β-CD was 1.4，1.6 and 1.7 times higher than that of the blank group; and 10(－10)mol/L 2HP-β-CD had the most significant effect in promoting the proliferation of HUVECs (all P＜0.01).No significant difference was found in OD(450)of the two groups when we added 10(－7)，10(－6)and 10(－5)mol/L 2HP-β-CD to HUVECs.The migration of HUVECs which were added with 2HP-β-CD at the concentration of 10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L in the experimental group was significantly higher than that of the blank group (all P＜0.05).When we added other concentrations of 2HP-β-CD，no significant difference was found in the cell migration between the experimental and blank groups.ConclusionSuitable concentrations of 2HP-β-CD can promote the migration and proliferation of HUVECs.

Key words:2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin; umbilical vein endothelial cells; cell migration; cell proliferation; angiogenesis

(收稿日期:2015-01-30)

通信作者簡介:徐克(1954-)，男，教授，博士，研究方向為介入放射學。E-mail: kexu@ vip.sina.com

作者簡介:第一戚勛(1980-)，女，講師，血管分子生理學博士，研究方向為缺血模型的血管新生。E-mail: qixun716@ hotmail.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81201168) ;遼寧省教育廳一般項目(L2012282)。

文章編號:1002-266X(2015) 18-0004-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R331.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.002