李萬(wàn)福，李一聰

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣州 五山 510640)

花生油黃曲霉毒素B1的危害及其檢測(cè)的研究進(jìn)展

李萬(wàn)福，李一聰

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣州 五山 510640)

黃曲霉毒素B1是當(dāng)今世上最強(qiáng)的生物毒素，對(duì)人和動(dòng)物具有致癌性和致畸性?；ㄉ屈S曲霉菌最喜歡的寄主之一，黃曲霉毒素隨著生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)入油脂中。因此本文主要討論花生油成品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，并對(duì)這些方法的適用性進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。

黃曲霉毒素；花生油；檢測(cè)

花生是我國(guó)最重要的油料經(jīng)濟(jì)作物之一，在油脂生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位。伴隨著新世紀(jì)的第7個(gè)中央一號(hào)文件正式發(fā)布，中國(guó)花生產(chǎn)業(yè)迎來(lái)了春天。在我國(guó)，花生油是花生的主要利用途徑，在食用植物油中僅次于菜籽油和大豆油，居全國(guó)第3位。然而，花生也是黃曲霉菌最容易侵染的對(duì)象，毒素會(huì)隨著油脂進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。

1 黃曲霉毒素概況

1.1 黃曲霉毒素的理化特性

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)有毒的次生代謝產(chǎn)物，是一群結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，可分為B1、B2、G1、G2、M1和M2等18種。它們的結(jié)構(gòu)都含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌性有關(guān)。黃曲毒素難溶于水，易溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑；能耐高溫，加熱至280℃以上才開(kāi)始分解，所以一般加熱不易破壞其結(jié)構(gòu)。黃曲霉毒素一般在中性溶液中較穩(wěn)定，遇強(qiáng)堿迅速分解，但在酸性條件下能發(fā)生可逆反應(yīng)。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有谷物在30℃，相對(duì)濕度80%，含水量在14%以上都能作為黃曲霉菌的寄生基質(zhì)，且在24～30℃條件下黃曲霉菌產(chǎn)毒素能力最強(qiáng)。黃曲霉毒素毒性很大，在所有真菌毒素和化學(xué)毒物中其毒性最強(qiáng)，是世界公認(rèn)的分布最廣、毒性最強(qiáng)、危害最大的一類(lèi)毒素，被世界衛(wèi)生組織列在重點(diǎn)研究的毒物首位。其中B1的毒性最強(qiáng)，是目前已知毒性最強(qiáng)的致癌物。黃曲霉毒素已被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類(lèi)致癌物。

1.2 黃曲霉毒素的危害

花生是最容易受到黃曲霉菌污染的農(nóng)作物之一，若加工企業(yè)對(duì)成品油檢測(cè)不嚴(yán)格把關(guān)，則可能致使含有黃曲霉毒素的食用油流入市場(chǎng)。人若食用含黃曲霉毒素的食用油，毒素隨著食物鏈會(huì)在人體中累積，最終會(huì)誘發(fā)多種病變，甚至癌癥。黃曲霉毒素的毒性極強(qiáng)，比氰化鉀還毒，可與眼鏡蛇毒性相當(dāng)。急性中毒主要是侵犯肝臟，引起肝臟壞死。人的肝癌與黃曲霉毒素有無(wú)關(guān)系？到目前為止，還不能說(shuō)黃曲霉毒素與肝癌有直接的因果關(guān)系，但國(guó)內(nèi)外大量調(diào)查結(jié)果認(rèn)為：盡管黃曲霉毒素不是誘發(fā)肝癌的唯一原因，而某些地區(qū)的肝癌發(fā)病與黃曲霉毒素的攝入密切相關(guān)。我國(guó)肝癌高發(fā)區(qū)廣西福綏縣和江蘇省東縣的調(diào)查證明(都是以玉米為主食的地區(qū))，每人每天黃曲霉毒素吃得越多，肝癌的發(fā)病率也越高，在這些地區(qū)肝癌的發(fā)生與黃曲霉毒素的攝入的確有關(guān)。花生也是最容易受到黃曲霉污染的作物之一，花生油則是廣東人最喜愛(ài)的食用油，花生油中黃曲霉毒素超標(biāo)的事件已屢見(jiàn)不鮮。因此，在食品安全受到高度關(guān)注的現(xiàn)代社會(huì)，花生油黃曲霉毒素的檢測(cè)是必不可少的環(huán)節(jié)，只有嚴(yán)格控制質(zhì)量，才能有效地保護(hù)人們的身體健康。

2 黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

目前檢測(cè)黃曲霉毒素的方法眾多，如薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、微柱篩選法、微柱快速法、近紅外線分析儀測(cè)定法等。在現(xiàn)行的糧油衛(wèi)生國(guó)標(biāo)中，往往以薄層色譜(TCL)、高效液相法(HPLC)作為黃曲霉毒素的分析方法，雖然其各有優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一定的局限性。隨著檢測(cè)和分析技術(shù)的不斷提高，黃曲霉毒素分析方法也有很大改善，如近紅外線分析儀測(cè)定法，在一定程度上提高了檢測(cè)的敏感性，但其成本較高，很難被企業(yè)接受。因此，尋求一種簡(jiǎn)單、精確、成本較低的檢測(cè)方法是大勢(shì)所趨，本文主要回顧花生油中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，并對(duì)其這些方法的適用性進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。

2.1 薄層色譜(TCL)

薄層色譜是一種非常有用的反應(yīng)跟蹤手法，也是檢測(cè)黃曲霉毒素的經(jīng)典方法之一。2003年已被列為檢測(cè)食品、飼料中黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)方法。薄層色譜的原理是樣品中AFTB1經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凈化、濃縮并薄層色譜分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光照射下，AFB1顯紫色，并根據(jù)其熒光的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品AFTB1最低檢出量產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比較，來(lái)測(cè)定樣品中AFTB1的含量。薄層色譜法分為單向展開(kāi)法和雙向展開(kāi)法，由于該檢測(cè)方法所用的設(shè)備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、容易掌握，因此該方法仍在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普遍使用。單向展開(kāi)法干擾多、操作繁鎖、費(fèi)時(shí)，且樣品的純度不夠，容易造成檢測(cè)的噪音，導(dǎo)致檢測(cè)效果不佳。雙向展開(kāi)法雖避免了雜質(zhì)干擾，但增加了操作步驟和時(shí)間，同時(shí)提純過(guò)程中可能導(dǎo)致樣品的損耗，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，該檢測(cè)方法只屬于定性和半定量檢測(cè)，而花生油作為人類(lèi)日常生活用品，其安全性的重要性不言而喻，定性和半定量檢測(cè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足其需要。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法具有分離效能高、選擇性好，靈敏度高、分析速度快、適用范圍廣的特點(diǎn)，已成為食用油檢測(cè)的常用方法。其原理是在高效液相色譜儀上添加柱后衍生系統(tǒng)分離，再用熒光檢測(cè)器測(cè)定。常用的方法是柱色譜法，處理方法相對(duì)繁瑣，且操作過(guò)程需要使用大量有機(jī)溶劑，對(duì)人體有一定危害性。當(dāng)前，該方法大多用免疫親和柱凈化分離，凈化效果優(yōu)異。該法能準(zhǔn)確地分離不同種類(lèi)的黃曲霉素，檢測(cè)速度快且定性與定量準(zhǔn)確，檢測(cè)限低，整個(gè)分析操作可在15min中完成。但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，分析操作人員需要有很豐富的儀器操作經(jīng)驗(yàn)，因此該方法一般企業(yè)實(shí)驗(yàn)室較少采用。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

該法是利用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，將黃曲霉毒素B1特異性抗體包被于聚乙烯微量反應(yīng)的孔穴中，再加入樣品提取液及酶標(biāo)AFB1抗原，使兩者與抗體之間進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，37℃孵育2h,倒掉反應(yīng)液，PBS-T洗液洗板3次，拍干。加入稀釋后標(biāo)二抗，37℃孵育1h，倒掉反應(yīng)液，PBS-T洗液洗板5次，拍干，然后加酶底物顯色, 37℃孵育15min,直接加入終止液，立即放入酶標(biāo)儀中，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值。一般來(lái)說(shuō)，顏色的深淺取決于抗體和酶標(biāo)AFB1抗原結(jié)合的量，即樣品中AFB多則被抗體結(jié)合的酶標(biāo)AFB1抗原少，顏色淺，反之則深。通過(guò)作黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)樣品該方法已廣泛用于食品、糧油等產(chǎn)品，也被國(guó)家列為糧油中檢測(cè)黃曲霉毒素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T52009.22-2003)。該方法的最低檢測(cè)濃度為0.01ug/kg,靈敏度高，易受其他微境的影響，導(dǎo)致結(jié)果有假陽(yáng)性現(xiàn)象，因此樣品的前處理就顯得相當(dāng)重要。在提取食用油黃曲霉毒素時(shí)，推薦使用低沸程石油醚(60～90)溶解黃曲霉毒素，然后取用甲醇-水(1∶1)溶液提取，提取液要分次沖洗裝有樣品的燒杯，盡量減少誤差。

2.4 免疫親和柱凈化-熒光快速檢測(cè)技術(shù)

該技術(shù)是采用國(guó)內(nèi)自主研制的AFB1專用熒光快速檢測(cè)儀及配套的免疫親和試劑盒建立的一套快速檢測(cè)方法。馬良等人通過(guò)研究，用70%甲醇對(duì)樣品進(jìn)行初步提取，過(guò)濾脫脂，稀釋后用免疫親和微柱純化富集，洗脫液放入黃曲霉毒素專用熒光定量速測(cè)儀器中自動(dòng)控制讀取結(jié)果。該方法的檢測(cè)最低濃度為0.3μg/kg,平均回收率超過(guò)90%，變異系數(shù)低于5%，操作時(shí)間可以控制在45min左右，避免了人過(guò)長(zhǎng)時(shí)間與有毒品溶劑接觸，且檢測(cè)成本低于其他儀器和方法。

3 展望

隨著生活水平的提高和科技的進(jìn)步，尋找一種高效、快速的黃曲霉毒素的檢測(cè)方法將成為研究的熱點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附法和免疫親和柱凈化-熒光快速檢測(cè)技術(shù)一個(gè)共同的特點(diǎn)就是都是使用特異性抗體與AFB1結(jié)合，尋求一個(gè)更加高效的特異性抗體仍然是今后的研究趨勢(shì)，隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程等技術(shù)的不斷研究，在不久的將來(lái)一定可以在食用油黃曲霉毒素的檢測(cè)中帶來(lái)新的技術(shù)和方法。

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