張 東

(遼寧省興城市南大動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧興城 125100)

遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的診斷及其防治措施制定

張 東

(遼寧省興城市南大動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧興城 125100)

蜜蜂的囊狀幼蟲病是中華蜜蜂常見且危害嚴重的疾病。通過流行病學(xué),臨床癥狀,病理變化及RT—PCR和電鏡觀察等多種方法對本病作出診斷,再確定本病后,制定出有效的預(yù)防措施和治療方法。

中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒;RT—PCR;電鏡觀察

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 蜜蜂為遼寧某蜂場飼養(yǎng)的中華蜜蜂，染病蜂群為自然條件下感染囊狀幼蟲病毒的蜂群。

1.1.2 試劑 氯仿，Trizol，異丙醇，75%乙醇，無核酸酶純水（Nuclease—Free water），華千藤，紫草，金銀花，甘草，五加皮，貫眾，金剛烷，病毒靈。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)，紫外分光光度計，超低溫高速離心機，RT—PCR試劑盒，電子顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 流行情況與臨床癥狀

2013年3月份遼寧某蜂廠，中蜂幼蟲在6～7日齡時出現(xiàn)大量死亡，約有三分之一死于封蓋前，三分之二死于封蓋后。蟲體黃灰色，尸體不腐爛，無粘性、無臭味。幼蟲形成一個囊狀體。根據(jù)臨診癥狀和流行病學(xué)特點，疑似CSBV感染。

1.2.2 RT-PCR 檢測

（1）提取病毒RNA

取上述2只幼蟲，分別置于1.5ml放入EP管內(nèi)，用玻璃棒研磨，磨碎后加入1ml Trizol，用槍頭吹打數(shù)次，靜置5min。加入0.2ml氯仿，震蕩搖勻15s，靜置3min。4℃，10000g離心15min。吸上清水相，加入另一EP管中，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10min。4℃，10000g離心10min。棄上清，用1ml75%乙醇洗RNA沉淀，沉淀懸起。4℃7500g離心5min。吸去乙醇，用1ml75%乙醇洗RNA沉淀，沉淀懸起。4℃7500g離心5min。吸去乙醇，自然風(fēng)干5～10min。用Nuclease—Free water溶解RNA沉淀，-80℃保存。以瓊脂糖電泳和紫外分光光度計（260 nm）吸收值測定所抽總RNA的質(zhì)量和濃度。.用2%的磷鎢酸鈉（pH 6.8）對每個小格負染90s。

（2）進行RT-PCR

用本課題組設(shè)計的引物F：5'CAAGGTGGCTTCAGAAATAG 3'（相應(yīng)Gen-Bank AF469603 病毒基因組的序列為521～541 bp），R：5' GCGTGAGTTGACAGAAAATC 3'（相應(yīng)病毒基因組的序列為852～872bp），進行RT-PCR。

用引物為oligo dT-Adaptor Primer，進行反轉(zhuǎn)錄，條件為：30℃ 10min，42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。-20℃保存。

對cDNA進行PCR擴增，條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性45S，56℃退火45S，72℃延長45S，共計30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min，結(jié)束后4℃保存。

（3）病毒純化

取疑似感染的幼蟲凍存在-70℃，用時拿出。取感染CSBV病毒的幼蟲放在5ml NT buffer（100 mM NaCl，10 mM Tris pH 7.4）里，使其成勻漿狀，然后離心，1000g，10min。取上清，用相同體積的三氯三氟乙烷萃取，加入CsCl，用SW50的轉(zhuǎn)子離心，270000g，1h，收取CsCl表面的物質(zhì)，加入CsCl調(diào)整體積到5 ml（最終密度1.38 g/cm3），用270000轉(zhuǎn)離心過夜。之后形成兩條光散射帶，分別進行收集，然后用NT buffer進行稀釋，然后進行沉淀，270000g，1h，最后用NT buffer重新懸浮沉淀。

（4）電鏡觀察

通過病毒分離程序得到的樣本用低速離心機（8000g，10min）清除雜質(zhì)，用毛細管吸取100ul上清液，直接滴在有支持膜的網(wǎng)上，懸液在網(wǎng)上呈半球形。數(shù)分鐘后，用一片干凈濾紙從網(wǎng)邊吸去液體。稍干后用另一毛細管吸一滴染色液滴在網(wǎng)上染色1min至2min左右。用濾紙吸去染液，立即進行電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨診癥狀

病死蟲外觀在封蓋前死亡的病蟲頭部上翹、白色、無臭味，體表失去光澤，用鑷子很容易從巢房中拉出，內(nèi)部組織液化，外皮堅韌，提起末端呈“囊狀”。在封蓋后死亡的病蟲，其巢蓋變成暗黑色，下凹，有穿孔。發(fā)病初期，蜂群中工蜂尚有能力將死蟲清除出巢房、蜂箱外，但當(dāng)蜂群發(fā)病嚴重后，工蜂將難以及時、徹底的清除病死幼蟲。未被清除的死蟲干枯后，脫離巢房壁，皺縮扭曲，成“龍舟狀”。

2.2 RT—PCR擴增

利用設(shè)計的特異性引物，從cDNA中利用RT-PCR的方法成功地擴增了一段長約350 bp的片段。其大小與設(shè)計引物所預(yù)期的擴增片段的大小351 bp大小一致。

2.3 電鏡觀察

通過電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子，其直徑大約26nm。

2.4 防治措施

藥物防治：目前，治療中蜂囊狀幼蟲病多采用具有清熱解毒的中草藥。由于病毒易產(chǎn)生抗藥性，某些藥物剛開始使用時有效，而重復(fù)使用后效果不理想。因此，在進行藥物防治時，應(yīng)交叉用藥，并加強飼養(yǎng)管理。

2.5 防治方法

根據(jù)囊狀幼蟲病病毒特點及中蜂囊狀幼蟲病的發(fā)病規(guī)律，在防治上應(yīng)采取“以選育抗病蜂種為主，加強飼養(yǎng)管理和藥物治療為輔”的綜合防治措施。

3 討論

3.1 本病的初步診斷

通過流行病學(xué)，臨床癥狀和病理變化初步判斷

3.2 關(guān)于藥物防治

目前，還沒有一種好的化學(xué)藥物能夠有效地治療蜜蜂病毒性疾病，而中草藥的防治效果較好，凡有清熱解毒作用的中草藥都有一定療效，如半枝蓮、板藍根、大青葉、貫眾、金銀花、菊花等。

4 結(jié)論

（1）通過臨床癥狀，病理變化，電鏡觀察在遼寧地區(qū)檢測出了CSBV。

（2）由于病毒易產(chǎn)生抗藥性，某些藥物剛開始使用時有效，而重復(fù)使用后效果不理想。因此，在進行藥物防治時，應(yīng)交叉用藥，并加強飼養(yǎng)管理。

[1] 中國農(nóng)業(yè)百科全書——養(yǎng)蜂卷[M].農(nóng)業(yè)出版社，1993.