王秀媛綜述，劉玉英審校

(寶坻中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，天津 301800)

1 直接臨床標(biāo)本的檢測

1.1 直接從臨床標(biāo)本中檢測病原體成分及抗原應(yīng)用單克隆抗體結(jié)合各種形式的標(biāo)記技術(shù)可以檢出臨床標(biāo)本中痕量的微生物抗原，免去細(xì)菌或病毒培養(yǎng)的過程，直接完成微生物感染的快速診斷。如應(yīng)用斑點(diǎn)酶免疫測定(EIA)、熒光免疫試驗(FIA)或金標(biāo)法檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、肺炎支原體，快速、直觀[1]；針對結(jié)核分枝桿菌的表面抗原或脂阿拉伯聚糖(GMA)制成單抗，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或斑點(diǎn)酶免疫測定(EIA)直接檢測標(biāo)本中的TB抗原[2]，Hillemann等用CapiliaTB產(chǎn)品檢測結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原，在172例結(jié)核桿菌陽性的臨床標(biāo)本的檢測中陽性檢出率為97%，特異性達(dá)100%；直接檢測糞便中的O157：H7大腸埃希菌抗原，Takeda等用膠體金免疫層析條直接檢測水樣便中的EHEC O157，報道檢測限為5×l05cfu／ml，與培養(yǎng)法相比一致率為89.10%，與ELISA法相比一致率為87.2%，但膠體金免疫層析法用時僅5min[3]；又如直接檢查糞便中的幽門螺桿菌抗原(HpSA),2004年國內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于HpSA免疫快檢卡診斷HP感染的首次報道，其敏感性為92.6%．特異性為88.5%．總的檢測準(zhǔn)確性為90.6%[4]，該方法適用于幽門螺桿菌感染的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷,也適用于HP的根除療效觀察和隨訪復(fù)查，更適用于老年于老人、兒童、孕婦及不宜做胃鏡檢查的患者，臨床實(shí)驗室可以把HpSA檢測作為HP感染的常規(guī)檢查項目,值得在臨床實(shí)施和推廣[5，6]；美國BinaxNow肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒可直接用于尿液和腦脊液標(biāo)本的檢測，用于肺炎球菌性肺炎和肺炎球菌性腦膜炎的診斷；還有采用各種不同載體如聚苯乙烯粒子(Latex)、明膠粒子、碳末、含蛋白A的金黃色葡萄球菌、膠體金等制成凝集試劑，直接測定糞便標(biāo)本中的輪狀病毒、腦脊液中的腦膜炎奈瑟菌、B型流感桿菌，以及鏈球菌的分群(A、B、C、D 等群)等。

真菌的檢測，通過檢測真菌細(xì)胞壁的β-1,3葡聚糖 (G試驗)，β-1,3葡聚糖在有些真菌細(xì)胞壁>50%，用動態(tài)濁度法來檢測，可檢測念珠菌、毛孢子菌、曲霉、鐮刀霉、支頂孢霉、卡氏肺孢子菌，可用于以上真菌的早期診斷和動態(tài)反應(yīng)感染程度及抗真菌治療效果[7]，研究顯示敏感性和特異性分別為(63%~100%)和(74%~100%)，缺陷在于容易引起假陽性，而且無法區(qū)別真菌種類[8]；半乳甘露聚糖(GM試驗)試驗，半乳甘露聚糖是曲霉菌細(xì)胞壁成分，菌絲在生長過程中釋放，曲霉菌、隱球菌、青霉/擬青霉GM試驗陽性，GM試驗其靈敏度可達(dá)1ng/ml,ELISA檢測血清中半乳甘露聚糖用于診斷曲霉具有良好的敏感性 (64.5%~100%)和特異性 (80%~98.7%)，可以用于曲霉的早期診斷和治療監(jiān)測；在臨床試驗中可通過G+GM試驗對不同感染的真菌進(jìn)行檢測可提高試驗準(zhǔn)確度[9-11]。

1.2 檢查某些細(xì)菌的專有酶進(jìn)行快速鑒定 已發(fā)現(xiàn)某些具有特征性的酶，應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜锟裳杆偻瓿杉?xì)菌鑒定。如沙門菌具有辛酸酯酶，以4MU-辛酸酯酶為底物，經(jīng)沙門菌酶解，在紫外燈下觀察游離4MU的熒光，國內(nèi)已有應(yīng)用[12]；卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯酶色原底物快速鑒定；大腸埃希菌具有β-葡萄糖醛酸酶，但以O(shè)157：H7為代表的腸出血性大腸埃希菌(EHEC)卻不具此酶，故葡萄糖醛酸酶陰性以成為初步篩查EHEC的重要特征[13]；白念珠菌具有脯氨酸肽酶及N-乙酰β-D半乳糖苷酶，分別以適當(dāng)?shù)牡孜餀z測試驗只需20min，兩酶陽性為白念珠菌；難辨梭菌具谷氨酸脫氫酶(GDH)，應(yīng)用此酶的IgG抗體(兔抗GDH)包被固相檢測卡，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測糞便中的GDH[14，15]等。

1.3 快速檢出細(xì)菌的毒素 自臨床標(biāo)本中直接檢出細(xì)菌的毒素，常比細(xì)菌培養(yǎng)更可靠。已應(yīng)用難辨梭菌的單抗以快速凝集或EIA法自糞便標(biāo)本中直接檢出毒素A或B進(jìn)行診斷[16]；產(chǎn)毒素埃希菌(ETEC)感染的診斷主要依靠查細(xì)菌的熱敏毒素(LT)與耐熱毒素(ST)可應(yīng)用其單抗以多種免疫學(xué)手段檢出；應(yīng)用反向被動乳膠凝集發(fā) (Oxoid公司試劑)快速檢測葡萄球菌的毒性休克綜合征毒素-I(TSST-I),可及時診斷出球菌所致的中毒性休克綜合征。

1.4 檢測機(jī)體對感染的免疫應(yīng)答 正常情況下，細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌受機(jī)體的嚴(yán)格的調(diào)控，在炎癥的情況，某些細(xì)胞因子的表達(dá)量可成百上千倍的增加。如白細(xì)胞介素(IL-6、IL-10、TNF-α)在炎癥時可快速上升，且半衰期很短，可作為急性感染的早期輔助診斷；C反應(yīng)蛋白(CRP)可用于細(xì)菌和病毒感染的鑒別診斷，一旦發(fā)生炎癥，CRP水平即升高，而病毒感染CRP大都正常，膿毒血癥CRP迅速升高，而依賴血培養(yǎng)至少需要48h，且其陽性率不高，又如CRP能快速有效地檢測細(xì)菌性腦膜炎，其陽性率達(dá)99%；降鈣素原(PCT)在細(xì)菌性感染時3~4h即可升高，半衰期接近24h，能快速反饋治療成效(每24h降低50%的濃度)，PCT反映感染的嚴(yán)重程度，健康者一般低于0.05ng/ml,局部感染在0.05~0.5ng/ml之間，全身性感染在0.5~2.0ng/ml，嚴(yán)重感染膿毒癥一般在2-10ng/ml,而膿毒癥休克>10ng/ml，根據(jù)PCT的測定值可以反映抗生素的治療療效，如PCT值在應(yīng)用抗生素或更改抗生素后測定值持續(xù)下降，說明治療是有效的，對細(xì)菌的感染診斷具有高特異性，可以改善臨床診斷，血液中的水平快速升高，半衰期超過24h，隨著疾病的進(jìn)展和加重水平持續(xù)升高，感染有效控制后水平快速下降，有效指導(dǎo)抗生素的使用，檢測方法方便，體內(nèi)外穩(wěn)定性高，不受糖皮質(zhì)激素的影響，結(jié)合臨床背景進(jìn)行個體化診斷和治療[17]；γ-干擾素釋放試驗(IGRA)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子(IFN-γ)，有研究實(shí)驗該方法敏感性為96.1%，特異性為95%;T-SPOT.TB是較靈敏和特異的快速檢測結(jié)核分枝桿菌感染的方法[18]，因此檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染者的診斷，由于效應(yīng)T淋巴細(xì)胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可作為機(jī)體是否正處于被感染者的指標(biāo)[19]。

2 細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏的快速試驗

一系列的商品化的顯色培養(yǎng)基進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗室，將標(biāo)本直接接種所需的不同要求的顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，大大縮短了臨床致病菌的檢測和鑒定時間還能降低實(shí)驗室成本。如大家比較關(guān)注的艱難梭菌顯色培養(yǎng)基、真菌顯色培養(yǎng)基等[20]；還可以根據(jù)培養(yǎng)基生長的菌落顏色變化可判讀是否為耐藥菌株，如MRSA、ESBL、VRE、等培養(yǎng)基，比傳統(tǒng)方法至少節(jié)約時間1~2d[21-23]；Nitrocefin紙片法可以快速檢測培養(yǎng)出的革蘭陽性球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌的β-內(nèi)酰胺酶；快速鑒定MRSA和MRCNS的快速乳膠凝集試驗(日本生研公司)可檢出親和力降低的青霉素結(jié)合蛋白 (PBP2a)[24]；BBL公司的MGIT(Mycobacterial Growth Inhibitor Tube)于結(jié)核桿菌TH9培養(yǎng)中加入異煙肼、利福平等藥物及熒光指示劑，在365nm的紫外燈下觀察有無熒光而判斷敏感或耐藥，試驗僅需4~5h，從而實(shí)現(xiàn)快速結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗；Jacobs等將熒蟲酶的基因?qū)虢Y(jié)核桿菌的噬菌體，噬菌體只侵入活的結(jié)核桿菌而發(fā)出熒光，將菌體與一定濃度的藥物作用后，如菌體存活則感染噬菌體，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光，即為耐藥，無熒光者為敏感。

近十幾年來，病原微生物的快速診斷方法發(fā)展很快，ELISA快速檢測抗原及抗體技術(shù)已被普遍的應(yīng)用，簡化了過去繁瑣的微生物學(xué)的檢測手續(xù)，特別是采用單克隆抗體，進(jìn)一步提高了檢測的特異性和敏感性。目前已制備出許多診斷試劑盒，其中病毒的快速診斷試劑盒的廣泛應(yīng)用，使過去長期難以實(shí)現(xiàn)的病毒病的快速實(shí)驗診斷成為現(xiàn)實(shí)。自動免疫分析儀的誕生，為感染性疾病的血清學(xué)診斷提供了許多簡便、快速、靈敏和特異的新手段。20世紀(jì)90年代，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸雜交技術(shù)、基因測序和PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，使某些不能培養(yǎng)、培養(yǎng)需很長時間和需特殊培養(yǎng)條件的微生物引起的感染性疾病的基因診斷成為可能[25-28]。隨著新技術(shù)發(fā)展的日新月異，大大提高了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗診斷水平及效率。

[1]劉小芹.某地區(qū)2870例泌尿生殖道支原體培養(yǎng)及藥敏檢測結(jié)果分析[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2014,32(1):95-96.

[2]楊淑華,張月香.結(jié)核病實(shí)驗室診斷技術(shù)進(jìn)展[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(6):570-572.

[3]Takeda T，Yamagata K，Youhida Y，et a1．Evaluation of immunochromatography based rapid detection kit for fecal Escherichiacoli 0157[J]．KansenShogakuZasshi,1998,72(8)：834—839.

[4]李宜輝，郭紅，張朋彬，等.HpSA免疫檢測卡檢測幽門螺旋桿菌糞便抗原的臨床價值[J].重慶醫(yī)學(xué),2004,3(1):79-80．

[5]李澤文.1203例胃鏡檢查患者幽門螺桿菌快速尿素酶試驗檢測結(jié)果分析[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(6):625-626.

[6]鄭冬云,潘杰,鄭海紅,等.幽門螺旋桿菌糞便抗原快速免疫卡檢測幽門螺桿菌糞便抗原的臨床評價[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010,26(24):4591-4593.

[7]Chaudhuri R,Ansari FA,Raghunandanan MV,et al.FungalRV:adhesin prediction and immunoinformatics portal for human fungal pathogens[J].BMC genomics，2011,12：192.

[8]Aquino VR ，Goldani LZ，Pasqualotto AC．U pdate on the contribution of galactomannan for the diagnosis of inva sive aspergillosis[J]．Mycopathologia,2007,163(4):191-202.

[9]Sulahian A，Boutboul F，Ribaud P，et al．Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of invasive aspergillosis in tow adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective tudy[J].Cancer,2001,91(2):311-318.

[10]Preiffer CD，F(xiàn)ine JP，Safdar N．Diagnosis of invasive as pergilloisis using a galactomannan assay ：a metal analysis[J]．Clin Infect Dis,2006,42(10):1417-1427.

[11]Guo YL，Chen YQ，Wang K，et al．Galactomannan in diag nosing invasive aspergillosis：a bivariate metaanalysis and systematic review[J]．Chest,2010,138:817-824.

[12]Mateos-Diaz E，Rodriguez JA， de Los Angeles Camacho-Ruiz ML，et al.High-throughput screening method for lipases/esterases[J].Methods Mol Biol,2012,861:89-100.

[13]Myette JR， Shriver Z，Kiziltepe T，et al.Molecular cloning of the heparin/heparan sulfate delta 4,5unsaturated glycuronidase from Flavobacterium heparinum,itsrecombinantexpression in Escherichia coli,and biochemical determination of its unique substrate specificity[J].Biochemistry,2002,41(23):7424-7434.

[14]Chapin K.Discrepancies in testing recommendations for Clostridium difficile infection:updated review favors amplification test systems[J].Expert Rev Mol Diagn,2012,12:223-226.

[15]王賢軍,羅麗.艱難梭菌感染的實(shí)驗室檢測檢測技術(shù)及臨床意義[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(10):799-800.

[16]金大智,羅蕓,羅麗,等.多重?zé)晒釶CR結(jié)合Allglo探針技術(shù)檢測CD相關(guān)毒素基因[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(1):32-35.

[17]褚丹,張慶憲,焦鵬飛,等.聯(lián)合檢測降鈣素原與癌胚抗原在胸腔積液中的診斷價值[J].中國實(shí)用醫(yī)刊,2014,41(10):34-36.

[18]肖倩,黃旭峰.T-SPOT.TB試驗快速檢測結(jié)核桿菌感染的臨床應(yīng)用研究[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2009,27(3):272-274.

[19]孔令和,柯云霞,高素香,等.IFN-γ 釋放試驗(T-SPOT.TB)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(6):535-537.

[20]劉輝,李桂珍,劉琳,等.科瑪嘉真菌顯色培養(yǎng)基的臨床應(yīng)用[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(2):190-191.

[21]胡嬋,朱紅梅,譚宏月,等.不同蛋白培養(yǎng)基對紅色毛癬菌生長形態(tài)的影響[J].中國真菌學(xué)雜志,2014,9(3):139-142,146.

[22]許英,陳友華.肺部侵襲性曲霉菌感染的實(shí)驗室檢查[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013,10(1):108-109.

[23]岑葉平,常子燕,裘莉佩,等.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢測結(jié)果分析 [J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013,25(06):696-698,701.

[24]Nair V，Dutta M,Manian SS,et al.Identification of penicillinbinding proteins employing support vector machines and random forest[J].Bioinformation,2013,9(9):481-484.

[25]陳瑩,袁建芬,喻海種,等.雙探針FQ-PCR法與基因測序法聯(lián)合檢測乙肝病毒耐藥基因[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(21):91-93.

[26]王鈺,夏涵,王豐,等.應(yīng)用表面等離子體共振生物傳感器快速檢測厭氧菌的研究 [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011，21(10):1963-1967.

[27]白瑞.核酸雜交基因芯片法檢測人乳頭狀瘤病毒結(jié)果分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(23):84-84,87.

[28]杭亞平,胡龍華,王小中.質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)驗與檢驗醫(yī)學(xué),2014,32(1):1-4.