許園園， 李曉剛， 李 慧， 藺 經(jīng)， 常有宏

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

梨是重要的溫帶果樹之一，屬于薔薇科蘋果亞科，大多數(shù)的栽培品種都是二倍體(2n =34)。作為國(guó)際市場(chǎng)上受歡迎的水果之一，梨在6 個(gè)大洲都有廣泛的種植，梨的主產(chǎn)國(guó)家有中國(guó)、美國(guó)、意大利、阿根廷、西班牙、韓國(guó)、土耳其、南非、日本和比利時(shí)，其中，中國(guó)為梨世界第一大生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)量超過世界總產(chǎn)量的60%［1-3］。

鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)是植物和一些原生生物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可不需鈣調(diào)素而被鈣信號(hào)直接激活，在植物中，CDPK基因以翻譯后形成的單肽鏈形式存在，典型的CDPK 蛋白分子由1 條多肽鏈組成，從N 端到C端存在4 個(gè)功能域［4-6］。在植物的器官水平上，CDPK基因廣泛存在于根、莖、葉、果實(shí)和種子等器官，在植物鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，在細(xì)胞水平上，分生細(xì)胞、木質(zhì)部細(xì)胞、花粉細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞和胚細(xì)胞中也均發(fā)現(xiàn)CDPK 蛋白組分的存在，且越來越多的研究結(jié)果表明，在植物碳氮代謝、離子和水分跨膜運(yùn)輸、氣孔運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)中均有CDPK 基因的參與，CDPK 在植物耐非生物脅迫的傷害應(yīng)答和抗真菌的防衛(wèi)應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用［7］。CDPK 基因在植物中數(shù)量眾多，在模式植物擬南芥的基因組中，迄今已鑒定了34 個(gè)CDPK 基因，分布位于所有5 條染色體上［8］;在水稻中，也已鑒定出29 ～31 個(gè)CDPK 家族成員［9］;據(jù)推測(cè)，小麥基因組中也至少存在20 個(gè)CDPK 基因［10］;另外，在大豆［11］、玉米［12］、番茄［13］、煙草［14］和棉花［7］中也鑒定了一些CDPK 基因;盡管對(duì)CDPK 基因的研究有了重大進(jìn)展，但大多局限于模式植物中，而且仍有大部分的CDPK 基因未得到分離與功能鑒定。梨基因組序列的公布為利用生物信息學(xué)手段研究該重要果樹作物成為可能，但是目前在全基因組水平上對(duì)梨CDPK 基因家族成員進(jìn)行分離鑒定的工作尚未見報(bào)道。

本研究利用生物信息學(xué)分析方法，基于已公布的梨基因組全序列信息，分離鑒定出全部CDPK 基因家族成員，從基因組水平上分析了梨CDPK 基因的數(shù)目，基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化，為在基因組范圍內(nèi)研究CDPK 基因家族的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

梨全基因組序列，基因及其注釋信息均下載于梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://peargenome. njau. edu. cn:8004/)。擬南芥CDPK 基因(34 個(gè))序列和蛋白序列下載于TAIR(http://www. arabidopsis. org/)。水稻CDPK 基因根據(jù)Asano 等［15］的研究結(jié)果，下載自http://rgp. dna. affrc. go. jp/E/IRGSP/rap-db1. html數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到31 條CDPK 蛋白序列。

試驗(yàn)于2014 年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 CDPK 基因家族成員鑒定

利用現(xiàn)有梨注釋基因的蛋白序列，與擬南芥、水稻CDPK 蛋白序列進(jìn)行本地blastp 比對(duì)，E-value值為le-5，輸出最優(yōu)比對(duì)結(jié)果，根據(jù)比對(duì)長(zhǎng)度(＞400 aa)和相似度(＞40%)篩選梨候選CDPK基因。同時(shí)結(jié)合Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用hmmscan 鑒定候選CDPK 基因蛋白結(jié)構(gòu)域，篩選含有CDPK 蛋白典型結(jié)構(gòu)域絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)以及EF-手型結(jié)構(gòu)區(qū)(PF07714，PF00036)的蛋白序列［16］。綜合上述結(jié)果，去除重復(fù)基因，得到26 條梨CDPK基因，根據(jù)其與擬南芥CDPK基因的相似性來命名。利用ExPASy Proteomics Sever (http://expasy.org/)對(duì)所有的CDPK 蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)［17］。氨基酸修飾，同樣采用在線工具進(jìn) 行，Myristoylator 工具(http://prosite. expasy.org/scanprosite/)用于進(jìn)行N-myristoylation 預(yù)測(cè)(http://prosite. expasy. org/scanprosite/)［18］，palmitoylation 預(yù)測(cè)工具為CSS-Plam program［19］，在線工具h(yuǎn)ttp://www. ebi. ac. uk/Tools/pfa/ps_scan/用于進(jìn)行EF-手型結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)［20］。

在梨26 個(gè)CDPK 基因中進(jìn)行重復(fù)基因?qū)Y選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為:(1)比對(duì)長(zhǎng)度大于兩個(gè)基因中最長(zhǎng)基因序列長(zhǎng)度的80%;(2)比對(duì)相似性＞80%;(3)只有一個(gè)重復(fù)事件才被認(rèn)為是緊密關(guān)聯(lián)的基因?qū)?。重?fù)CDPK 基因?qū)Φ腒a、Ks 值計(jì)算采用DnaSP5.0 軟件，最后根據(jù)Ka/Ks 值來判斷每對(duì)基因的選擇壓力［21］。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與蛋白保守域序列比對(duì)分析

通過ClustalW 模塊對(duì)擬南芥、水稻、梨CDPK 蛋白進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì)分析，多序列比對(duì)結(jié)果使用MEGA6.0(http://megasoftware. net)程序［22］采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)生成CDPK 基因的無根系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 重復(fù)1 000 次。CDPK基因家族保守性分析采用ClustalX 生物學(xué)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并參照Schneider 等［23］的方法進(jìn)行蛋白序列保守性分析。

1.4 CDPK 基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，利用perl 程序從梨基因組注釋信息(pear. gene. gff)中提取梨CDPK 基因的基因組注釋信息(gff)，得到梨CDPK 基因的基因組(Scaffold)位置信息?；贑DPK 的基因和CDS序列，選取GSDS(http://gsds. cbi. pku. edu. cn/)工具進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，繪制外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。

1.5 梨CDPK 基因與水稻、擬南芥的無根系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用MEGA6.0 程序中的ClustalW 模塊對(duì)梨、擬南芥和水稻的CDPK 蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)生成無根進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 梨PbCDPKs 基因家族成員鑒定

利用生物信息學(xué)方法，從梨全基因組中鑒定獲得26 個(gè)候選CDPK 基因家族成員，根據(jù)與擬南芥CDPK 基因的同源性分別命名為PbCDPK1 ～PbCDPK26(表1)。通過ExPASy 工具，對(duì)梨CDPK 基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、分子量及等電點(diǎn)等生化屬性分析?；蚪M序列分析結(jié)果表明梨CDPK 基因非常保守，最長(zhǎng)的梨CDPK 蛋白(PbCDPK6，Pbr010446.1)編碼811 個(gè)氨基酸，最短的CDPK 蛋白(PbCDPK24，Pbr027545.1)僅編碼499 個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)生化屬性分析發(fā)現(xiàn)，其等電點(diǎn)范圍從4. 79(PbCDPK22，Pbr028710.1)到8. 77(PbCDPK16，Pbr007825. 1)(表1)。

2.2 梨PbCDPK 家族成員氨基酸序列保守性分析

利用PFAM 及NCBI-CDD 工具對(duì)CDPK 家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在與Ca2+結(jié)合的調(diào)控區(qū)，CDPK 成員均含有一段結(jié)構(gòu)和功能類似于CaM 的氨基酸序列，這段序列中除PbCDPK16 含有3 個(gè)與Ca2+結(jié)合的EF-手型結(jié)構(gòu)，其余均包含4 個(gè)EF 手型結(jié)構(gòu)(圖1)。此外，部分CDPK 成員N 端還發(fā)現(xiàn)了含有與蛋白質(zhì)定位(膜定位)相關(guān)的豆蔻?；褪轷；璧谋Ｊ匦蛄蠱GXXC(S/Q)XXT 位點(diǎn)(表1)。

2.3 梨PbCDPKs 家族基因結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解梨CDPK 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用梨CDPK 蛋白全長(zhǎng)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，26 個(gè)CDPK 基因可以分為4 類，參考擬南芥的研究結(jié)果，將4 類亞家族命名為Class Ⅰ、Class Ⅱ、Class Ⅲ和Class Ⅳ，分別含10 個(gè)、4 個(gè)、10 個(gè)和2 個(gè)CDPK 基因。此外，26 個(gè)CDPK 基因形成11 個(gè)旁系同源基因?qū)?，其中只? 對(duì)基因步長(zhǎng)值低于90，為PbCDPK17/PbCDPK15(圖2)。對(duì)家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析顯示，梨CDPK 基因結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，有18 個(gè)CDPK 基因內(nèi)含子數(shù)目為6 ～7 個(gè)，僅有1 個(gè)成員含有5 個(gè)內(nèi)含子(PbCDPK3)，1 個(gè) 成 員 含 有 10 個(gè) 內(nèi) 含 子(PbCDPK16)，3 個(gè) 成 員 含 有 8 個(gè) 內(nèi) 含 子(PbCDPK6、PbCDPK14)，2 個(gè)成員含有9 個(gè)內(nèi)含子(PbCDPK1、PbCDPK22)，另有2 個(gè)CDPK 基因不含內(nèi)含子(PbCDPK7、PbCDPK24)。對(duì)CDPK成員聚類結(jié)果的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，位于同一旁系同源基因?qū)χ械幕蚱浣Y(jié)構(gòu)同樣類似(圖2)。另外，對(duì)PbCDPK 家族成員編碼序列與基因組序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，在9 個(gè)PbCDPK 家族成員基因序列中存在UTR 非翻譯區(qū)域(圖2)。

為了深入分析梨與其他物種的同源進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了梨與擬南芥、水稻的CDPK 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，根據(jù)進(jìn)化樹聚類，可將所有的CDPK蛋白分為四類，分別為CDPK I，CDPK II，CDPK III，CDPK IV。CDPK I 包含了10 個(gè)AtCDPK，8 個(gè)OsCDPK 和10 個(gè)PbCDPK;CDPK II 中分別包含13個(gè)AtCDPK，5 個(gè)OsCDPK 和4 個(gè)PbCDPK;CDPK III 中分別包含8 個(gè)AtCDPK，8 個(gè)OsCDPK 和10 個(gè)PbCDPK;CDPK IV 中在四類分組中含有基因數(shù)目最少，分別包含3 個(gè)AtCDPK，2 個(gè)OsCDPK 和2 個(gè)PbCDPK。

表1 梨CDPK 基因家族成員信息Table 1 The information of CDPK gene family in pear

3 討論

目前，基因家族分析已在多種作物中有類似報(bào)道，如蘋果SDH 和IPT 基因家族［24-25］，大豆LEA 與ARF 基因家族［26-27］，番茄LBD 基因家族等［28］，為各個(gè)基因家族的功能分析提供了理論基礎(chǔ)。CDPK 是植物體內(nèi)含有Ser/Thr 激酶活性的一類蛋白激酶，研究結(jié)果表明，CDPK 是介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境信號(hào)的關(guān)鍵信號(hào)傳遞體［7，29-30］。在植物體內(nèi)，CDPK基因以家族基因的形式存在，在對(duì)模式植物擬南芥基因組的搜索中發(fā)現(xiàn)CDPK 含有34 個(gè)成員，楊樹基因組中被鑒定含有30 個(gè)成員［31］，在其他植物如馬鈴薯、豌豆等作物中也發(fā)現(xiàn)了部分CDPK 基因家族成員。梨作為一種重要的果樹作物，基因組測(cè)序完成后，有關(guān)梨CDPK 家族基因的分析研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)梨進(jìn)行全基因組掃描分析，從梨基因組中成功鑒定出26 個(gè)CDPK 家族成員，通過對(duì)其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析，以期為深入揭示該基因家族在梨生長(zhǎng)發(fā)育與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖2 梨CDPK 基因內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)與家族進(jìn)化樹分析Fig.2 The intron-exon structures and the phylogenetic tree of CDPK genes in pear

總體來說，梨CDPK 基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，外顯子數(shù)目較多(6 ～11 個(gè))，這種復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且復(fù)制時(shí)容易產(chǎn)生可變剪切。研究報(bào)道，大多數(shù)的CDPK 基因在調(diào)控區(qū)含有4 個(gè)保守的與Ca2+結(jié)合的EF-手型結(jié)構(gòu)，少數(shù)CDPK 含有3 個(gè)EF-手型結(jié)構(gòu)，本研究中，還發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)CDPK成員含有6 個(gè)EF-手型結(jié)構(gòu)。通過這些手型結(jié)構(gòu)可使CDPK 在不依賴于CaM 的條件下與Ca2+高度親和。另外，部分CDPK 成員N 端存在與蛋白質(zhì)定位(膜定位)相關(guān)的豆蔻?；褪轷；璧谋Ｊ匦蛄蠱GXXC(S/Q)XXT 位點(diǎn)，推測(cè)這些結(jié)構(gòu)可能在參與蛋白質(zhì)與質(zhì)膜的可逆結(jié)合或蛋白間相互作用過程中發(fā)揮重要作用。

通過系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，可以分析基因之間的起源關(guān)系，預(yù)測(cè)基因的功能。同一亞家族或小的分枝往往具備相似的功能，依據(jù)聚類分析，梨26 個(gè)CDPK 蛋白成員劃分為4 組(CDPK I、CDPK II、CDPK III 和CDPK IV)，表明梨CDPK 蛋白來自于不同的祖先，另外研究結(jié)果顯示，CDPK I、CDPK III 和CDPK IV 在3 個(gè)物種(梨、擬南芥和水稻)中分別含有大致相同數(shù)量的CDPK，而較另外兩個(gè)物種(梨和水稻)，CDPK II 則僅在擬南芥中含有數(shù)量較多的CDPK 成員，該聚類結(jié)果與棉花CDPK 蛋白分類相一致［7］，由于植物種屬的CDPK 可能來自于蛋白激酶和CaM 基因的融合，因此，CDPK 各成員的結(jié)構(gòu)與序列組成上的較大差異，可能與蛋白激酶或CaM 在序列上存在的差異有關(guān)。3 個(gè)物種的親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果表明，所有的CDPK 蛋白在3 個(gè)物種中均被分成不同的4 個(gè)類別，暗示這些分組在單子葉植物與雙子葉植物分化前就已存在，該結(jié)論同樣支持了在藻類和陸生植物分化前CDPK 家族基因就已被分為4 類的假設(shè)［32］。

圖3 梨CDPK 蛋白與擬南芥、水稻CDPK 蛋白的親緣關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationships of CDPK proteins in Arabidopsis，rice and pear

隨著研究深入，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的梨CDPK同源基因，這些CDPK 家族基因如何響應(yīng)激素信號(hào)調(diào)控梨生長(zhǎng)發(fā)育，如何參與對(duì)逆境反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)等都將成為今后研究的重點(diǎn)。

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