管 莉， 張阿英

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210095)

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids，BR)作為一種新型甾醇類植物激素，參與并調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及對脅迫響應(yīng)過程［1-3］。許多研究結(jié)果表明，BR 可以通過提高植物的抗氧化防護(hù)酶活性來增強(qiáng)植物對脅迫的耐受能力［4-5］，活性氧、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)［5-6］、鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(Calcium-calmodulin dependent protein kinase，ZmCCaMK)等都參與BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)，然而關(guān)于BR 誘導(dǎo)植物抗氧化防護(hù)的詳細(xì)機(jī)理還不十分清楚。

近些年一些研究結(jié)果表明，鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)也參與了植物對多種環(huán)境刺激和脅迫的響應(yīng)機(jī)制，如鹽脅迫、干旱脅迫等［7-8］。Desikan等［9］研究發(fā)現(xiàn)外源H2O2可以誘導(dǎo)CaM 基因的表達(dá)。外源脫落酸(Abscisic acid，ABA)、H2O2或者水分脅迫都可以顯著提高玉米葉片中CaM 含量，而且CaM 抑制劑試驗(yàn)結(jié)果也表明CaM 參與ABA 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)［10］。但CaM 是否參與BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程還不清楚。因此，本試驗(yàn)以玉米農(nóng)大108 為材料，研究CaM 在BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中的作用，并且進(jìn)一步研究CaM 和ZmCCaMK 在BR誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中的關(guān)系，以期深入了解BR誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)機(jī)制，為進(jìn)一步了解植物在抗逆過程中的響應(yīng)機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

玉米農(nóng)大108 購自中國種子公司，瞬時表達(dá)載體 pXZ-ZmCCaMK 由本實(shí)驗(yàn)室馬芳芳構(gòu)建，ZmCCaMK抗體由金斯瑞公司制備。

PEG4000、甘露糖醇、三氟乙酸、KI、2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1 萘-黃胺［N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene sulphonmide hydrochloride，W7］和三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)為Sigma 公司產(chǎn)品;離析酶R-10、纖維素酶R-10 為日本Yakult Honsha 公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)試劑盒、定量試劑盒、ELISA 購自TaKaRa 公司;RNA 干擾試劑盒購自Promega 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植株培養(yǎng)和處理 將玉米幼苗置于光照恒溫箱中(晝夜溫度28 ℃/22 ℃，每天光照14 h，相對濕度60%)培養(yǎng)7 d。然后，挑選長勢一致的玉米幼苗，參照Ma 等的方法［11］，用CaM 拮抗劑W7(200 μmol/L)、TFP(100 μmol/L)預(yù)處理4 h，再用BR 處理30 min，取第2 片葉子并置于液氮中備用。另外，將玉米種子置于蛭石-泥炭土(1∶ 1)中，并在暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)?shù)? 片葉高出第1 片葉10 ～15 cm 時，從基部剪取第2 片葉，用于玉米原生質(zhì)體的提取。

1.2.2 dsRNA 的體外轉(zhuǎn)錄合成 參照Ma 等的方法［11］合成ZmCCaMK 的dsRNA。

1.2.3 玉米原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化 參照Zhu 等的方法［4］，提取玉米原生質(zhì)體。玉米原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是采用聚乙二醇(40% PEG4000)融合法。將高純度的重組質(zhì)粒100 μg ubi-YFP-ZmCCaMK (以空載ubi-YFP 為對照)或者150 μg dsRNA (以雙蒸水為對照)加入到1 ml 原生質(zhì)體中，再加入1. 1 ml PEG 溶液(0.6 mol/L 甘露 醇，40% PEG4000，0.1 mol/L CaCl2)，輕輕混勻，25 ℃靜置13 ～15 min;加入4.4 ml W5 溶液(125 mmol/L CaCl2，154 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH 5.7)混勻，1 000 g 離心3 min，棄上清;加1 ml 培養(yǎng)液(0.6 mol/L 甘 露 醇，4 mmol/L MES，4 mmol/L KCl，pH5.7)，25 ℃培養(yǎng)過夜;用10 nmol/L BR 處理30 min 后，收集玉米原生質(zhì)體，以測定CaM 含量。

1.2.4 葉片總RNA 的提取及cDNA 的制備 將0.1 g 玉米葉片用液氮充分研磨，并溶于RNA 提取試劑Trizol 中，然后參照Ding 等的方法［12］進(jìn)行總RNA 的提取及RNA 濃度和純度的檢測。最后，將提取得到的RNA 按照反轉(zhuǎn)試劑盒的說明將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.5 定量RT-PCR 及數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 對ZmCCaMK基因進(jìn)行相對定量RT-PCR 分析:采用SYBR ?Premix Ex TaqTM試劑盒，以ZmACTIN 為內(nèi)參引物。ZmCCaMK (DQ403196)的引物序列:5'-CTCAAGCCCGAGAACTGCC-3' 和5'-TGGCAGCCGAGACATCC-3';ZmACTIN (J01238)的引物序列:5'-GTTTCCTGGGATTGCCGAT-3' 和 5'-TCTGCTGCTGAAAAGTGCTGAG-3'。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照試劑盒說明。每個樣品重復(fù)3 次，取平均值，用2-△△Ct的方法計(jì)算待測基因的相對表達(dá)量，其中，基因在各處理0 min 時的相對表達(dá)量設(shè)定為1.0。

1.2.6 免疫沉淀和激酶凝膠反應(yīng) 將處理后的葉片用液氮研磨成粉末，加入1 ml 蛋白質(zhì)提取液［100 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)pH 7. 5，5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5 mmol/L 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，10 mmol/L Na3VO4，10 mmol/L NaF，50 mmol/L β-磷酸甘油，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，5 μg/ml亮抑酶肽(Leupeptin)，5 μg/ml 抑肽酶(Aprotinin)，5%甘油］，4 ℃，12 000 g 離心0.5 h，取上清，采用Bradford 方法［13］計(jì)算蛋白質(zhì)含量，分裝并凍于－70 ℃待用。免疫沉淀和激酶凝膠反應(yīng)步驟參照Ma 等的方法［11］。將得到的X 光片用Quantity One軟件進(jìn)行量化處理，將對照點(diǎn)設(shè)定為1.0，其余各處理點(diǎn)的相對值由處理點(diǎn)的數(shù)值除以對照的值。

1.2.7 酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定CaM 含量 收集過夜培養(yǎng)后的原生質(zhì)體，加入2 倍體積的預(yù)冷提取液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EGTA，0.5 mmol/L PMSF，20 mmol/L NaHSO4，0.15 mol/L NaCl)，渦旋震蕩2 min(可用超聲波破碎);4 ℃12 000 g 離心0.5 h，參照ELISA 試劑盒(TaKaRa 公司產(chǎn)品)方法測定原生質(zhì)體中CaM 含量，鈣調(diào)素含量以μg/mg表示(以蛋白質(zhì)計(jì))。

1.2.8 H2O2含量的測定 H2O2含量的測定參照張超強(qiáng)等的方法［14］。0.5 g 的玉米葉片，加入預(yù)冷的4 ml 三氟乙酸研磨，12 000 g 離心30 min;取0.5 ml上清液，加入等體積10 mmol/L磷酸緩沖液和2 倍體積的1 mol/L KI，在390 nm 處測定吸光值，H2O2含量以ng/g 表示(以鮮質(zhì)量計(jì))。

1.2.9 抗氧化酶的活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性測定均參照Zhang 等的方法［5］。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 每個處理重復(fù)5 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 軟件，用Ducan’s 法分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 外源BR 誘導(dǎo)對玉米葉片葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體CaM 含量的影響

為了研究外源BR 對玉米葉片原生質(zhì)體中CaM含量的影響，用10 nmol/L BR 處理分離得到的玉米葉片原生質(zhì)體，并測定CaM 含量。結(jié)果(圖1)表明:與對照相比，外源BR 處理顯著提高了玉米葉片原生質(zhì)體中CaM 含量，CaM 含量在BR 處理30 min時達(dá)最大值，增加了2.8 倍，隨后開始下降，到60 min 時下降到正常水平。

圖1 10 nmol/L 油菜素內(nèi)酯(BR)處理不同時間后玉米葉片葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體鈣調(diào)素(CaM)含量的變化Fig.1 Time course of calmodulin(CaM)content in maize mesophyll protoplasts treated with 10 nmol/L brassinosteroids (BR)

2.2 CaM 參與BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)

為了確定CaM 是否參與BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程，玉米植株預(yù)先用CaM 拮抗劑處理4 h，再用10 nmol/L BR 處理30 min(水處理為對照)，測定抗氧化防護(hù)酶SOD、APX 的活性以及H2O2含量的變化。結(jié)果(圖2)顯示CaM 拮抗劑幾乎完全抑制了BR 誘導(dǎo)的玉米葉片中抗氧化防護(hù)酶SOD、APX 的活性，這表明CaM 參與了BR 誘導(dǎo)的玉米葉片的抗氧化防護(hù)。

2.3 CaM 對BR 誘導(dǎo)的ZmCCaMK 基因表達(dá)以及激酶活性、H2O2含量的影響

為研究CaM 和ZmCCaMK 在BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中的關(guān)系，首先用CaM 拮抗劑W7 和TFP 預(yù)處理玉米幼苗，再通過熒光定量PCR 技術(shù)測定玉米葉片中ZmCCaMK 基因表達(dá)量，同時用凝膠激酶反應(yīng)測定ZmCCaMK 的激酶活性。結(jié)果表明:CaM 抑制劑的預(yù)處理能顯著降低BR 誘導(dǎo)的ZmCCaMK 基因表達(dá)和激酶活性增加，而W7 和TFP 本身對其沒有影響(圖3)。此外，CaM 拮抗劑W7 和TFP 預(yù)處理也顯著抑制了BR 誘導(dǎo)的H2O2積累。這些結(jié)果說明CaM 參與BR 誘導(dǎo)的ZmCCaMK 活化及H2O2積累。

圖2 CaM 拮抗劑TFP 和W7 預(yù)處理對BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶SOD 和APX 的影響Fig.2 Effects of pretreatment with CaM antagonists of TFP and W7 on BR-induced antioxidant enzymes SOD and APX

圖3 鈣調(diào)素拮抗劑預(yù)處理對BR 誘導(dǎo)的玉米葉片中ZmCCaMK 基因表達(dá)和激酶活性、H2O2含量的影響Fig.3 The effects of pretreatment with CaM antagonists on ZmCCaMK expression and the activities of ZmCCaMK，and the content of H2 O2

2.4 瞬時表達(dá)和瞬時沉默ZmCCaMK 基因?qū)R誘導(dǎo)的原生質(zhì)體中CaM 含量的影響

采用原生質(zhì)體瞬時表達(dá)及瞬時沉默體系，瞬時表達(dá)及瞬時沉默ZmCCaMK 基因，并經(jīng)BR 處理30 min，以轉(zhuǎn)化空載為對照，然后用酶聯(lián)免疫法測定樣品中CaM 含量。結(jié)果(圖4)表明:瞬時表達(dá)ZmCCaMK 基因后，CaM 含量明顯增加，并且BR 處理后仍有部分增加;瞬時沉默ZmCCaMK 基因后，CaM 含量明顯減少，且BR 處理也僅有略微增加。說明ZmCCaMK 也參與調(diào)節(jié)玉米葉片中BR 誘導(dǎo)的CaM含量。

3 討論

植物在整個生長發(fā)育過程中會受到各種不良環(huán)境的影響，如鹽脅迫、干旱脅迫等，這些非生物脅迫主要是干擾植物細(xì)胞中活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生和清除之間的平衡，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞遭受氧化脅迫。在正常條件下，ROS 的生成和清除處在一定的平衡狀態(tài)，不會對細(xì)胞造成損傷，但當(dāng)處于環(huán)境脅迫時，植物體內(nèi)ROS 急劇積累而使細(xì)胞受到氧化脅迫［15］。然而植物在長期的進(jìn)化中為了生存，在受到環(huán)境脅迫時，可以通過改變細(xì)胞代謝及誘導(dǎo)多種防御機(jī)制來響應(yīng)環(huán)境脅迫［16］。越來越多的研究結(jié)果表明，植物激素BR 在這一過程中起著十分重要的作用。Zhang 等［5］的研究結(jié)果表明BR 能誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗氧化防護(hù)酶活性上調(diào)，提高清除ROS 的能力，從而緩解干旱脅迫對植物造成的氧化損傷。Liu 等［17］的研究結(jié)果表明BR 可以誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)酶活性上調(diào)，從而減輕低溫對高山離子芥造成的氧化損傷。但對BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)機(jī)理的研究報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，BR 可以顯著提高玉米葉片葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的CaM 含量，同時CaM 拮抗劑試驗(yàn)結(jié)果表明，CaM 參與了BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶活性的提高以及H2O2的積累。這表明BR誘導(dǎo)的CaM 影響H2O2的積累，進(jìn)而提高了抗氧化防護(hù)酶SOD 和APX 活性。

圖4 瞬時表達(dá)及瞬時沉默ZmCCaMK 對BR 誘導(dǎo)的原生質(zhì)體CaM 含量的影響Fig.4 The content of CaM exposed to BR treatment in the protoplasts transiently expressing or transiently silencing ZmCCaMK

CaM 和ZmCCaMK 都參與BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程。為研究在BR 信號通路中它們之間的相互關(guān)系，本研究首先進(jìn)行了抑制劑試驗(yàn)，結(jié)果表明CaM 參與BR 誘導(dǎo)的ZmCCaMK 活化。為進(jìn)一步研究CaM 和ZmCCaMK 在BR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)系，我們借助玉米原生質(zhì)體瞬時表達(dá)及瞬時沉默體系瞬時表達(dá)及瞬時沉默ZmCCaMK 基因，發(fā)現(xiàn)ZmCCaMK也參與并調(diào)控玉米葉片中BR 誘導(dǎo)下CaM 的含量變化。這表明BR 可以誘導(dǎo)CaM，進(jìn)而激活ZmCCaMK，同時ZmCCaMK 也可以反過來影響B(tài)R 誘導(dǎo)的CaM 含量。近年來越來越多的研究結(jié)果表明，CaM 和H2O2等信號分子之間存在一個交叉對話機(jī)制［10，18］，因此推測CaM 和ZmCCaMK 在BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中可能存在這一個交叉對話機(jī)制。

綜上所述，CaM 在BR 誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中具有重要的作用，并且CaM 和ZmCCaMK 之間存在一個交叉對話機(jī)制，這對于深入研究BR 調(diào)控植物的抗逆應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)。

［1］ 阮英慧，董守坤，劉麗君，等. 干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯對大豆花期生理特性的影響［J］.作物雜志，2011，6:33-37.

［2］ 曹云英，趙 華. 高溫脅迫下油菜素內(nèi)酯對水稻幼苗的保護(hù)作用［J］.中國水稻科學(xué)，2007，21(5):525-529.

［3］ 張林青. 油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下番茄幼苗生理指標(biāo)的影響［J］. 北方園藝，2013 (1):1-3.

［4］ ZHU Y，ZUO M X，LIANG Y L，et al. MAP65-1a positively regulates H2O2amplification and enhances brassinosteroid-induced antioxidant defence in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2013，64(12):3787-3802.

［5］ ZHANG A Y，ZHANG J，YE N H，et al. ZmMPK5 is required for the NADPH oxidase-mediated self-propagation of apoplastic H2O2in brassinosteroid-induced antioxidant defence in leaves of maize［J］. Journal of Experimental Botany，2010，61(15):4399-4411.

［6］ XIA X J，WANG Y J，ZHOU Y H，et al. Reactive oxygen species are involved in brassinosteroid-induced stress tolerance in cucumber［J］. Plant Physiology，2009，150(2):801-814.

［7］ 張?jiān)葡?，?勇，王瑞剛，等. 初始鹽脅迫下ABA 與CaM 對胡楊葉片氣體交換的調(diào)控［J］. 林業(yè)科學(xué)，2008，44(1):57-64.

［8］ 谷俊濤，郭秀林. 水分脅迫下鈣，鈣調(diào)素對小麥幼苗生長及過氧化物酶同工酶的影響［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2001，16(3):62-67.

［9］ DESIKAN R，SOHEILA A H，HANCOCK J T，et al. Regulation of the arabidopsis transcriptome by oxidative stress ［J］. Plant Physiology，2001，127(1):159-172.

［10］ HU X L，JIANG M Y，ZHANG J H，et al. Calcium–calmodulin is required for abscisic acid-induced antioxidant defense and functions both upstream and downstream of H2O2production in leaves of maize (Zea mays)plants［J］. New Phytologist，2007，173(1):27-38.

［11］ MA F F，LU R，LIU H Y，et al. Nitric oxide-activated calcium/calmodulin-dependent protein kinase regulates the abscisic acid-induced antioxidant defence in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63(13):4835-4847.

［12］ DING Y F，CAO J M，NI L，et al. ZmCPK11 is involved in abscisic acid-induced antioxidant defence and functions upstream of ZmMPK5 in abscisic acid signalling in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2013，64(4):871-884.

［13］ BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Analytical Biochemistry，1976，72(1):248-254.

［14］ 張超強(qiáng)，楊穎麗，王 萊，等. 鹽脅迫對小麥幼苗葉片H2O2產(chǎn)生和抗氧化酶活性的影響［J］. 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，43(1):71-75.

［15］ FRYER M J，ANDREWS J R，OXBOROUGH K，et al. Relationship between CO2assimilation，photosynthetic electron transport，and active O2metabolism in leaves of maize in the field during periods of low temperature［J］. Plant Physiology，1998，116(2):571-580.

［16］ BOHNERT H J，JENSEN R G. Strategies for engineering waterstress tolerance in plants［J］. Trends in Biotechnology，1996，14(3):89-97.

［17］ LIU Y J，ZHAO Z G，SI J，et al. Brassinosteroids alleviate chilling-induced oxidative damage by enhancing antioxidant defense system in suspension cultured cells of Chorispora bungeana［J］.Plant Growth Regulation，2009，59(3):207-214.

［18］ HU X L，WANG W，LI C Q，et al. Cross-talks between Ca2+/CaM and H2O2 in abscisic acid-induced antioxidant defense in leaves of maize plants exposed to water stress［J］. Plant Growth Regulation，2008，55(3):183-198.