王艷梅，馮璇璘，鄧 磊，常 莉，章曉紅，梁宗安

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科，四川 成都 610041；2.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610072； 3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

Toll樣受體4參與鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

王艷梅1，2，馮璇璘3，鄧 磊3，常 莉3，章曉紅3，梁宗安1△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科，四川 成都 610041；2.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610072； 3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

Toll受體4(Toll like receptors，TLR4)可迅速識(shí)別鮑曼不動(dòng)桿菌釋放的脂多糖(LPS)，是鮑曼不動(dòng)桿菌肺部炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)閘門(mén)，當(dāng)其過(guò)度表達(dá)時(shí)則可引起相關(guān)的瀑布級(jí)聯(lián)的炎癥性疾病，從而增加病死率。抑制TLR4能應(yīng)用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎。

Toll受體4；鮑曼不動(dòng)桿菌；肺炎

近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院肺部感染的重要致病菌，其引起的醫(yī)院感染發(fā)生率呈總體上升趨勢(shì)，僅ICU醫(yī)院感染的病原菌中，不動(dòng)桿菌的感染就高于20%～66.7%，在移植、腎內(nèi)等重癥病房各種類型的嚴(yán)重感染(呼吸道、傷口皮膚、血流、泌尿生殖系統(tǒng)等感染)中，已成為首位的病原菌[1～4]。其中，鮑曼不動(dòng)桿菌所致肺炎在呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎中所占比例高達(dá)15%～25%，耐藥率高達(dá)40%～60%[5]，病死率高達(dá)29.5%～66.7%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅ICU人群的危險(xiǎn)因素[4，6]。

1 鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的發(fā)病機(jī)制

不動(dòng)桿菌屬非發(fā)酵革蘭陰性菌，只有醋酸鈣不動(dòng)桿菌一個(gè)種，由DNA雜交研究確定17個(gè)雜交群，其中6個(gè)已命名，11個(gè)尚未命名?，F(xiàn)已知致肺炎的不動(dòng)桿菌為鮑曼不動(dòng)桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、溶血不動(dòng)桿菌。該菌毒力最強(qiáng)株是鮑曼不動(dòng)桿菌AB5075，常定植于上呼吸道，由于口腔炎癥、氣管切開(kāi)、氣管插管，為其向下呼吸道運(yùn)動(dòng)、黏附、生物膜形成、離子獲得及移位創(chuàng)造了條件[7]。其中，鮑曼不動(dòng)桿菌通過(guò)形成生物被膜來(lái)抵御下呼吸道細(xì)胞免疫系統(tǒng)的作用，從而伺機(jī)致病。研究已表明，鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物膜是一種復(fù)雜而有序的過(guò)程，受多方面因素影響：①分泌細(xì)胞外酶產(chǎn)生脂溶性和細(xì)胞毒性作用；②外膜蛋白A等誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡；③黏附分子(菌毛和外膜蛋白A)使細(xì)菌黏附于上皮細(xì)胞；④K1莢膜結(jié)構(gòu)，1型菌毛和外膜蛋白A 誘導(dǎo)生物膜形成；⑤鐵載體或卟啉鐵介導(dǎo)離子獲??；⑥群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò) N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子和細(xì)胞成分協(xié)助不動(dòng)桿菌在的各種不利環(huán)境(干燥、低溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏等)下生存[8]。臨床上，鮑曼不動(dòng)桿菌肺部定植常為老年患者，他們往往有基礎(chǔ)疾病(慢性阻塞性肺疾病合并呼吸衰竭、糖尿病、腦梗死、各種晚期腫瘤、肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及接受化療、放療及激素治療后)，因而免疫力低下，頻繁采用侵入性的診療措施如氣管切開(kāi)、氣管插管、人工氣道機(jī)械通氣，導(dǎo)致住院時(shí)間長(zhǎng)[9]。利用阻斷生物膜形成環(huán)節(jié)達(dá)到防治的目的，在實(shí)驗(yàn)室和臨床已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，尤其是利用金屬螯合劑枸櫞酸鈉降低鈣、鎂離子，防治留置導(dǎo)管生物膜的形成，在臨床已經(jīng)取得一定療效。

盡管如此，鮑曼不動(dòng)桿菌在人肺泡上皮細(xì)胞表面的黏附及致病機(jī)制仍不明確。在基因水平、蛋白水平探討耐藥性基因片段和黏附的機(jī)制，可能為下一步阻斷鮑曼不動(dòng)桿菌抵御宿主防御從而成功定植與移位提供新思路。

移位及黏附于肺泡上皮細(xì)胞的鮑曼不動(dòng)桿菌主要通過(guò)產(chǎn)生毒力因子如外膜蛋白A、磷酸酯酶、脂多糖(LPS)、青霉素結(jié)合蛋白，外膜囊泡等攻擊宿主細(xì)胞，通過(guò)一系列的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)激活NF-κB信號(hào)通路，后者通過(guò)對(duì)多種基因表達(dá)的調(diào)控，調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-l、IL-6、IL-8誘導(dǎo)肺部炎癥[10]。臨床上，患者常有發(fā)熱，為不規(guī)則熱，可有咳嗽、胸痛、氣緊，氣道分泌物多，多為白色黏痰，偶有血性痰。肺部可有細(xì)濕啰音。肺部影像常呈支氣管肺炎的特點(diǎn)，亦可為大葉性或片狀浸潤(rùn)陰影，偶有肺膿腫及滲出性胸膜炎表現(xiàn)。周圍白細(xì)胞可正?；蛟龈?。

2 Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)參與鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的信號(hào)通路

2.1 TLR4 是一類表達(dá)于細(xì)胞膜上與微生物識(shí)別有關(guān)的受體家族。它們能夠識(shí)別特定微生物成分——病原體相關(guān)分子模式(pathogen asso-ciated molecular patterns，PAMPs)，內(nèi)毒素通過(guò)激活肺上皮細(xì)胞及天然免疫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，造成肺損傷[11]。TLRs在肺上的表達(dá)早有報(bào)道。亦有報(bào)道表明肺上皮細(xì)胞中有TLR mRAN的表達(dá)，但下呼吸道不同上皮細(xì)胞株有關(guān)TLR1～TLR10 mRNA的表達(dá)譜卻不盡相同。如永久化人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS2B)中有TLR1～TLR7和TLR9～TLR10 mRNA的表達(dá)，而人肺癌細(xì)胞系細(xì)胞(A549)中主要是TLR2～TLR6 mRNA的表達(dá)。其TLR的不同表達(dá)結(jié)果可能與肺泡上皮細(xì)胞的狀態(tài)、所使用的試劑、引物等因素有關(guān)[12]。在不同病理?xiàng)l件下，鮑曼不動(dòng)桿菌可能誘導(dǎo)不同TLR mRAN的表達(dá)。事實(shí)上，有研究通過(guò)建立LPS缺乏的鮑曼不動(dòng)桿菌株，發(fā)現(xiàn)感染鮑曼不動(dòng)桿菌的鼠來(lái)源巨噬細(xì)胞后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞株上清液中TNF-α含量降低2～3倍，采用Real-time PCR檢測(cè)NF-κB mRNA表達(dá)，其結(jié)果顯示，感染組水平均下降了2～3倍，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，更為重要的是，該實(shí)驗(yàn)還提示，TLR4與小鼠巨噬細(xì)胞感染鮑曼不動(dòng)桿菌的炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，TLR2與低水平炎癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此參與細(xì)菌感染并起核心作用的主要是TLR4[13]。

2.2 TLR4信號(hào)通路 鮑曼不動(dòng)桿菌釋放LPS，LPS進(jìn)入機(jī)體與血液中的LPS結(jié)合蛋白(LPB)結(jié)合成LPS-LPB復(fù)合物，與單核/巨噬細(xì)胞表面的CD14分子作用，進(jìn)一步形成LPS-LPB-CD14復(fù)合物，將信號(hào)傳導(dǎo)肺上皮細(xì)胞內(nèi)，然后通過(guò)MD-2蛋白激活TLR4，TLR4進(jìn)一步將LPS信號(hào)通過(guò)胞質(zhì)鋅金屬酶(LpxC)，影響脂蛋白A合成，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子(TRAF)、白介素受體相關(guān)激酶(IRAK)等下游分子向下傳導(dǎo)，最終活化NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)通路，導(dǎo)致大量前炎癥因子表達(dá)，如防御素、IL-8，而IL-8是發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞趨化因子中作用最強(qiáng)的一種[14，15]。有研究采用基因轉(zhuǎn)染法使人單核巨噬細(xì)胞THP-1 與 TLR-缺乏人體腎來(lái)源上皮細(xì)胞HEK-293 兩種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染人 TLR2 與 TLR4，并由臨床分離的五株鮑曼不動(dòng)桿菌分泌獲得內(nèi)毒素。經(jīng)內(nèi)毒素作用后，僅THP-1細(xì)胞株分泌IL-8和 TNF-α增加。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然紫外線殺死的鮑曼不動(dòng)桿菌可激活 TLR2和TLR4依賴的信號(hào)通路，但是，內(nèi)毒素僅誘導(dǎo) TLR4信號(hào)途徑[16]。另有實(shí)驗(yàn)采用野生鼠及TLR4缺乏小鼠，分離骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMs)及樹(shù)突狀細(xì)胞。鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 15150感染上述兩種細(xì)胞，ELISA法測(cè)定細(xì)胞分泌IL-6與TNF-α。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TLR4缺乏的巨噬細(xì)胞分泌IL-6與TNF-α未見(jiàn)增加，而TLR2缺乏的巨噬細(xì)胞兩種細(xì)胞因子均增高。表明，僅TLR4是鮑曼不動(dòng)桿菌作用于天然免疫細(xì)胞，致使其產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的必要通路。另外，Western blot分析提示核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-KB)和MAPKs(p38，ERK，and JNK)蛋白水平均增高，再次表明TLR4 -NF-KB與MAPKs是鮑曼不動(dòng)桿菌作用于天然免疫細(xì)胞的信號(hào)通路。

另有研究此通路可能還與細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)胞毒性作用有關(guān)。RT-PCR法檢測(cè)野生鼠分離的BMDMs細(xì)胞株一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的水平變化，野生鼠分離的BMDMs受鮑曼不動(dòng)桿菌感染后，不同時(shí)間組細(xì)胞株中的iNOS mRNA表達(dá)均較對(duì)照組有顯著升高，而TLR4缺乏的巨噬細(xì)胞受鮑曼不動(dòng)桿菌感染后，BMDMs細(xì)胞株iNOS mRNA的表達(dá)量無(wú)變化，提示TLR4在鮑曼不動(dòng)桿菌的載體感染的早期及細(xì)胞毒過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。

3 抑制TLR4用于鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎靶向免疫調(diào)節(jié)

Lin等構(gòu)建了TLR4突變體，運(yùn)用這種發(fā)生了點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究該受體的功能，再次證明TLR4介導(dǎo)小鼠鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種了從非致死劑量到致死劑量肺鮑曼不動(dòng)桿菌的TLR基因缺陷小鼠，與正常的野生型小鼠比較，僅僅產(chǎn)生很小的肺部炎癥反應(yīng)變化。與傳統(tǒng)觀念不同，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS劑量與鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥發(fā)病程度不成正相關(guān)，而與TLR4激活呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示TLR4其信號(hào)通路強(qiáng)度與機(jī)體免疫細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，但TLR4是小鼠對(duì)肺鮑曼不動(dòng)桿菌炎癥反應(yīng)的必不可少的啟動(dòng)因子?？筁pxC 單克隆抗體可明顯抑制鮑曼不動(dòng)桿菌LPS激活TLR4，提示LpxC 抑制劑能應(yīng)用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎[15]。

4 小結(jié)

綜上所述，鮑曼不動(dòng)桿菌釋放的LPS，誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)，后者通過(guò)NF-KB和MAPKS通路，引起肺內(nèi)的瀑布級(jí)聯(lián)的炎癥性疾病甚至導(dǎo)致死亡。抑制TLR4及其通路能應(yīng)用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎。

[1] Lahmer T，Messer M，Schnappauf C，et al.Acinetobacter baumannii sepsis is fatal in medical intensive care unit patients：six cases and review of literature[J].Anaesth Intensive Care，2014，42(5)：666-668.

[2] Zhang W，Wu YG，Qi XM，et al.Peritoneal dialysis-related peritonitis with Acinetobacter baumannii：a review of seven cases[J].Perit Dial Int，2014，34(3)：317-321.

[3] Al-Anazi KA，Al-Jasser AM.Infections Caused by Acinetobacter baumannii in Recipients of Hematopoietic Stem Cell Transplantation[J].Front Oncol，2014，4：186.

[4] Nunley DR，Bauldoff GS，Mangino JE，et al.Mortality associated with Acinetobacter baumannii infections experienced by lung transplant recipients[J].Lung，2010，188(5)：381-385.

[5] Lin MF，Lan CY.Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii：From bench to bedside[J].World J Clin Cases，2014，2(12)：787-814.

[6] Yamada K，Yanagihara K，Kaku N，et al.Azithromycin attenuates lung inflammation in a mouse model of ventilator-associated pneumonia by multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57(8)：3883-3888.

[7] Jacobs AC，Thompson MG，Black CC，et al.AB5075，a Highly Virulent Isolate of Acinetobacter baumannii，as a Model Strain for the Evaluation of Pathogenesis and Antimicrobial Treatments[J].MBio，2014，5(3)：1076-1090.

[8] Asik G.Current approaches to explain the virulence of Acinetobacter baumannii[J].Mikrobiyol Bul，2011，45(2)：371-380.

[9] Tsakiridou E，Makris D，Daniil Z，et al.Acinetobacter baumannii infection in prior ICU bed occupants is an independent risk factor for subsequent cases of ventilator-associated pneumonia[J].Biomed Res Int，2014，2014：193516-193523.

[10]McConnell MJ，Actis L，Pachon J.Acinetobacter baumannii：human infections，factors contributing to pathogenesis and animal models[J].FEMS Microbiol Rev，2013，37(2)：130-155.

[11]Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B，et al.Toll-like receptor and tumour necrosis factor dependent endotoxin-induced acute lung injury[J].Int J Exp Pathol，2007，88(6)：387-391.

[12]Rivas-Santiago B，Juarez E.Toll-like receptor in lung response to pathogens[J].Rev Invest Clin，2007，59(6)：481-488.

[13]Moffatt JH，Harper M，Mansell A，et al.Lipopolysaccharide-deficient Acinetobacter baumannii shows altered signaling through host Toll-like receptors and increased susceptibility to the host antimicrobial peptide LL-37[J].Infect Immun，2013，81(3)：684-689.

[14]March C，Regueiro V，Llobet E，et al.Dissection of host cell signal transduction during Acinetobacter baumannii-triggered inflammatory response[J].PLoS One，2010，5(4)：10033.

[15]Lin L，Tan B，Pantapalangkoor P，et al.Inhibition of LpxC protects mice from resistant Acinetobacter baumannii by modulating inflammation and enhancing phagocytosis[J].MBio，2012，3(5)：312.

[16]Erridge C，Moncayo-Nieto OL，Morgan R，et al.Acinetobacter baumannii lipopolysaccharides are potent stimulators of human monocyte activation via Toll-like receptor 4 signalling[J].J Med Microbiol，2007，56(Pt 2)：165-171.

[17]Kim CH，Jeong YJ，Lee J，et al.Essential role of toll-like receptor 4 in Acinetobacter baumannii-induced immune responses in immune cells[J].Microb Pathog，2013，54：20-25.

The Role of Toll like receptor 4 in pneumonia caused by Acinetobacter Baumannii

WANG Yan-mei，F(xiàn)ENG Xuan-lin，DENG Lei，CHANG Li，ZHANG Xiao-hong，LIANG Zong-an

四川省科技廳公益院所基本科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：13-4-405)

R563.1

B

1672-6170(2015)03-0151-03

2015-03-10；

2015-03-30)

△通訊作者，碩士生導(dǎo)師