涂青梅 田剛 鄭敏 姜禎珍 羅興均 趙翔

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是一種常見的并發(fā)癥，由嚴重的外傷或手術(shù)創(chuàng)傷引起。失血性休克復蘇(hemorrhagic shock followed by resuscitation，HSR)也被認為是一種損傷，因為它可以經(jīng)常引起全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，結(jié)果可能會導致MODS，其中包括急性肺損傷(acute lung injury，ALI)。ALI是臨床醫(yī)生面臨的主要問題，導致發(fā)病率和病死率明顯升高［1］。HS引起的SIRS的發(fā)病機制很復雜，與很多病理生理機制都有關系。目前被大部分人接受和認可的機制是缺血再灌注(ischaemia and reperfusion，I/R)以及對自身免疫細胞的刺激［2］。I/R損傷本身就可以誘發(fā)炎性反應，增加細胞因子的釋放、活性氧的生成、內(nèi)皮細胞活化、一氧化氮產(chǎn)量和粘附分子的表達［2］。HS發(fā)生后，被激活的中性粒細胞浸潤到受損肺部，內(nèi)皮細胞粘附分子的表達增加，局部細胞因子水平也升高［1］。作為一種具有選擇性和可逆性的半胱氨酰白三烯1(cysteinyl leukotriene 1，CysLT1)受體拮抗劑，孟魯司特常被用于治療過敏性鼻炎和哮喘［3］。對消炎藥誘發(fā)的潰瘍以及阿倫磷酸鈉引起的大鼠胃黏膜損傷，孟魯司特都具有胃保護作用，原因是減輕了氧化損傷和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性［4］。此外，由于其具有抗炎抗氧化作用，孟魯司特可減輕I/R引起的多種臟器的氧化損傷［5］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，白三烯的生物合成可以減輕HS引起的肺損傷［6］。然而，孟魯司特對HSR所致ALI的影響和作用，筆者尚未見文獻報道。本研究觀察孟魯司特對HS大鼠肺組織丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的影響，探討孟魯司特的肺保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年健康SD大鼠(SPF級)24只，體重200～250 g，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供。24只大鼠隨機分為3組(n=8):假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克復蘇致急性肺損傷模型組(HS組)、孟魯司特治療組(M組)。Sham組:在相同的時間內(nèi)接受相同的麻醉和手術(shù)過程成為休克動物，但既不是失血性休克也不進行液體復蘇;HS組:經(jīng)過心臟內(nèi)穿刺放血 1 h，失血量約為 50%(30 ml/kg)，失血性休克后再用林格氏液復蘇1 h，然后一直保留到實驗結(jié)束;M組:在放血前30 min接受孟魯司特7 mg/kg腹腔內(nèi)注射，在再灌注之前同樣的劑量再注射1次［5］。Sham組和HS組都接受了等量的乙醇溶液。

1.2 失血性休克模型的建立 用10%的水合氯醛350 mg/kg經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉。從左側(cè)胸部進行心臟內(nèi)穿刺，放血時間超過2 min以上，放血量為50%(30 ml/kg)，大鼠處于休克狀態(tài)持續(xù)時間為 1 h［4］，之后通過尾部靜脈輸注乳酸林格氏溶液進行復蘇，輸液量為失血量的2倍(60 ml/h)，輸液時間超過1 h以上。除了不放血和不復蘇之外，Sham組進行所有的實驗程序。整個實驗過程中，大鼠均保持自主呼吸。復蘇后2 h，大鼠被再次麻醉后從胸腔打開處放血處死，直接從心臟抽取血液樣本。保留肺組織，左肺制成勻漿儲存起來供研究使用;右肺用10%甲醛固定進行組織學檢查。

1.3 氧化應激測量的組織制備 通過超聲波液體處理器使肺標本成為均質(zhì)微粒，再用含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖鹽水進行處理，得到肺組織勻漿。4℃下，勻漿以 10 000 r/min離心15 min，保留上清以測定GSH和MDA［7］。作為脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，通過監(jiān)測硫代巴比妥酸反應物質(zhì)形成，從而對 MDA的水平進行分析。使用 1.56×105mol·L－1·cm－1的消光系數(shù)，MDA 類似物的脂質(zhì)過氧化反應被表達出來，表達形式為nmol MDA/g(組織)。使用412 nm比色法對GSH進行測定。

1.4 組織取樣及組織病理學檢查 實驗結(jié)束時，處死大鼠并取肺組織，用10%的甲醛緩沖液立即固定所有組織病理學標本，進行常規(guī)處理。顯微鏡下觀察部分標本的組織病理學改變。采用Matute-Bello等［8］創(chuàng)立的評分系統(tǒng)對肺損傷程度進行評估。該評分系統(tǒng)對肺泡間質(zhì)內(nèi)充血、肺泡內(nèi)細胞浸潤以及肺泡出血進行分級。每項指標被分為0～3級:肺泡間質(zhì)細胞，0:肺間質(zhì)細胞稀少;1級:肺間質(zhì)細胞＜1/3視野;2級:肺間質(zhì)細胞占據(jù)1/3～2/3視野;3級:肺間質(zhì)細胞＞2/3視野。肺泡內(nèi)細胞浸潤:0級，每視野肺泡內(nèi)皮細胞＜5個;1級:每視野肺泡內(nèi)皮細胞5～10個;2級:每視野肺泡內(nèi)皮細胞11～20個;3級:每視野肺泡內(nèi)皮細胞＞20個。肺泡出血，0級:沒有出血;1級:1～5個肺泡中，每個肺泡至少5個紅細胞;2級:5～10個肺泡中，每個肺泡至少5個紅細胞;3級:＞10個肺泡中，每個肺泡至少含5個紅細胞。單項指標得分相加，得到總的肺損傷評分。依據(jù)評分，肺損傷被分為三級:正常(0分);輕度(1～3分);中度(4～6分);重度(7～9分)。組織學切片由病理科醫(yī)生觀察評估。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平變化 作為肺組織脂質(zhì)過氧化反應的一個主要降解產(chǎn)物，HS組大鼠肺組織MDA水平與Sham組相比明顯升高(P＜0.05);而與HS組相比，M組大鼠肺組織MDA水平則有明顯降低(P＜0.05)。與Sham組相比，HS組大鼠肺組織GSH水平明顯降低(P＜0.05)，而M組則無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平比較n=8，±s

表1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平比較n=8，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.05;與 HS 組比較，#P ＜0.05

組別 MDA(nmol/g) GSH(μmol/g)Sham組95.0 ±2.8 4.36 ±0.27 HS 組 157.0 ±6.2* 2.12 ±0.25*M 組 115.1 ±5.2#3.54 ±0.40

2.2 3組大鼠急性肺損傷評分比較 Sham組大鼠的肺組織切片顯示，所有3個參數(shù)的表現(xiàn)均為正常(肺間質(zhì)細胞稀少，無肺泡內(nèi)細胞浸潤，無肺泡出血)。HS組與Sham組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，HS組總平均評分顯示為中度肺損傷。與HS組比較，M組大鼠肺損傷明顯減輕(P＜0.05)。總平均評分顯示輕度肺損傷。見表2。

表2 3組大鼠急性肺損傷評分比較n=8，分，±s

表2 3組大鼠急性肺損傷評分比較n=8，分，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.05;與 HS組比較，#P ＜0.05

組別 肺泡間質(zhì)充血 肺泡細胞浸潤 肺泡出血 總分 總分分級Sham組0000正常HS組 1.50±0.34 2.50 ±0.22 1.83±0.16 5.83 ±0.60* 中度M 組 1.00 ±0.25 1.33 ± 0.42 0.50 ±0.34 2.33 ±0.56#輕度

3 討論

HS會引起生化和組織學變化，從而導致ALI的發(fā)生。孟魯司特可以阻止HS后的生化改變，對肺組織有保護作用。Eun等項研究中證實，脂氧合酶5通路產(chǎn)物能夠減輕 HS后的急性肺損傷［9，10］。

通過新陳代謝試驗，GSH已被證實在宿主抗氧化應激反應中發(fā)揮了重要作用。氧化應激的另一個重要因素是MDA，它是自由基活化的標志。據(jù)報道，氧化應激可以明顯升高MDA水平而降低GSH水平，因此氧化應激很可能是HSR發(fā)病機制的一個重要因素［4］。本研究結(jié)果與Kilicogluet等［11］報道一致。本研究結(jié)果顯示，與HS組相比，孟魯斯特可明顯減少休克大鼠肺組織MDA水平的升高，同時明顯升高肺組織GSH的水平，這就提示孟魯斯特對HS誘導的氧化肺損傷有一定的保護作用。Seneret等［12］發(fā)現(xiàn)，在慢性腎功能衰竭導致的其他器官損傷模型中，孟魯司特可明顯降低肺組織MDA水平，同時升高肺組織GSH的水平。此外，有研究證實，孟魯司特通過其抗炎和抗氧化作用，可減輕大鼠肝臟、膀胱、睪丸和腎臟因I/R引起的氧化性損傷［4］。孟魯司特的抗氧化能力，一方面基于其自身作用，更重要的是因為它的抗炎作用，促炎細胞因子、趨化因子和被激活的補體因子會導致中性粒細胞的增加和隨后再灌注階段中性粒細胞引起的氧化應激。通過激活信號增加IL-8的生成，LTC4可影響GSH與GSSG的比率，如果用白三烯受體拮抗劑孟魯司特預處理，可明顯抑制LTC4誘導的細胞內(nèi)氧化還原反應時間依賴性變化，也通過抑制NF-κB的激活來抑制IL-8生成的上調(diào)［13］。另一方面，白三烯與炎性介質(zhì)關系密切，因為他們都有增加血管通透性的能力，這是I/R損傷的共同特征。

HS組總的平均分提示中度肺損傷，其中66.7%大鼠為中度肺損傷，33.3%大鼠為重度肺損傷。與HS組相比，孟魯司特對大鼠的治療明顯減輕了肺損傷，M組總的平均分提示輕度肺損傷。雖然沒有數(shù)據(jù)表明孟魯司特對HS大鼠肺實質(zhì)有保護作用，但Souza等證實了孟魯司特的治療可以改善退化的肺上皮細胞，明顯降低慢性腎功衰引起的多器官損傷大鼠肺部炎癥細胞的數(shù)量。此外，孟魯司特可預防發(fā)熱引起的肺損傷，因為它可以改善肺間質(zhì)出血引起的大量肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和消失［14］。以I/R為模型的各種研究表明，孟魯司特可以延緩不同器官的組織病理學變化，包括肝臟、腎臟和睪丸。本研究中，孟魯司特的抑制作用主要歸因于其平衡氧化-抗氧化狀態(tài)的能力以及減少促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，也可能抑制了中性粒細胞的激活和滲透。

綜上所述，孟魯司特能夠減輕失血性休克復蘇大鼠肺組織MDA水平的升高，從而減輕肺損傷，具有一定的肺保護作用。

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