張婷婷　馬磊

摘要：利用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶，分析了枯草桿菌啟動(dòng)子43及amy的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明，在基本培養(yǎng)基條件下，啟動(dòng)子43在對數(shù)前期開始表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性，隨菌量增大活性迅速提高，穩(wěn)定期逐步平穩(wěn)；在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，啟動(dòng)子43轉(zhuǎn)錄活性在對數(shù)前期與基本培養(yǎng)基條件下相似，在對數(shù)期轉(zhuǎn)錄活性增加速率則高于基本培養(yǎng)基條件下的增加速率；啟動(dòng)子43轉(zhuǎn)錄活性在E coli和B subtilis體內(nèi)基本一致。啟動(dòng)子amy在淀粉誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄活性較高，在添加葡萄糖以及無誘導(dǎo)條件下酶活較低。

關(guān)鍵詞：枯草桿菌；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄活性；基因表達(dá)

中圖分類號： Q933文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0056-02

啟動(dòng)子是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵，是表達(dá)載體的核心成分，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分析是表達(dá)載體構(gòu)建工作的重點(diǎn)之一。在枯草桿菌中常見啟動(dòng)子重疊和串連現(xiàn)象，例如RNA聚合酶σ43（σA）和σ37（σB）的識別區(qū)在胞嘧啶脫氨酶基因啟動(dòng)子43序列內(nèi)重疊[2]。σ43負(fù)責(zé)營養(yǎng)期的基因起始轉(zhuǎn)錄，而σ37負(fù)責(zé)對數(shù)晚期和平臺期早期的基因起始轉(zhuǎn)錄，因而啟動(dòng)子43可在多個(gè)時(shí)期起始轉(zhuǎn)錄，是理想的發(fā)酵工程啟動(dòng)子[3- 4]。本研究應(yīng)用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶基因（bgaB），分析啟動(dòng)子43及枯草桿菌α-淀粉酶基因啟動(dòng)子amy的轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步開發(fā)高效表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

材料

[2]菌株B subtilis A747和E coli DH5α購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；質(zhì)粒pEB-bgaB為筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該質(zhì)粒為大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體，攜帶β-半乳糖苷酶基因（bgaB）。限制性核酸內(nèi)切酶、堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購自romage公司，Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶購自寶生物公司，質(zhì)粒提取、DNA回收試劑盒購自杭州維特潔公司。

2方法

2引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中B subtilis基因組上的43和amy序列設(shè)計(jì)引物，43片段擴(kuò)增后保留其原有起始密碼子（ATG），上下游引物分別為5′-[ZZ（Z]CCGGATCC[ZZ）]TTGTAGAGCTCAGCAT-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）和5′-GG[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]CATGTGTACATTCCTC-3′（下劃線為stⅠ酶切位點(diǎn)）；amy片段擴(kuò)增后保留了原有信號肽序列，上下游引物分別為5′-AA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]GCTCATGCCGAGAATAGAC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）和5′-AT[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]TTCAGCACTCGCAGCCG-3′（下劃線為stⅠ酶切位點(diǎn)）。CR擴(kuò)增條件：92 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次。

22[2]載體構(gòu)建在載體pEB-bgaB上bgaB 5′端的BamHⅠ[2]和stⅠ酶切位點(diǎn)之間，分別插入經(jīng)回收并酶切的CR產(chǎn)物43和amy，獲得質(zhì)粒pEB-43-bgaB和pEB-amy-bgaB；載體構(gòu)建成功后，啟動(dòng)子片段43和amy可起始轉(zhuǎn)錄bgaB。載體電轉(zhuǎn)入E coli DH5α后，將感受態(tài)細(xì)胞涂布在含X-gal平板，挑選8 h內(nèi)出現(xiàn)明顯藍(lán)色菌落，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。挑取單菌落搖菌，測定整個(gè)生長時(shí)期β-半乳糖苷酶活性。

23β-半乳糖苷酶活性測定方法和定義[5]將一定體積菌液離心收集菌體，重懸于700 μL Z-buffer（006 mol/L Na2HO4·7H2O，004 mol/L NaH2O4，00 mol/L KCl，000 mol/L MgSO4·7 H2O和005 mol/L β-巰基乙醇，pH值70），加入0 μL Triton X 00（0%）和溶菌酶0 μL[3]（0 g/L），靜止30 min后加入鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONG）200 μL（4 g/L），混勻后置于55 ℃水浴5 min，加入[4]Na2CO3 500 μL（ mol/L）終止反應(yīng)，離心，取上清并測量其D420 nm。

酶活性（U）=[SX（]D420 nm× 000D595 nm×5（min）×V[SX）]（D595 nm為測前菌液吸光度；V為所用菌液的體積，mL）。

2結(jié)果與分析

CR擴(kuò)增獲得的43片段大小在250～500 bp之間，amy片段大小在500～750 bp之間（圖），與預(yù)計(jì)大小相符。

在基本培養(yǎng)基（胰蛋白胨%，酵母提取物05%，氯化鈉%）條件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）合成的β-半乳糖苷酶活性在對數(shù)前期開始表現(xiàn)，隨著菌量增大活性迅速提高，穩(wěn)定期后逐步平穩(wěn)，最高可達(dá)6 650 U，穩(wěn)定期后隨菌群衰退酶活下降（圖2）。在富營養(yǎng)培養(yǎng)基（胰蛋白胨2%，酵母提取物%，氯化鈉%）條件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）[CM（233]合成的 β-半乳糖苷酶活性在對數(shù)前期與基本培養(yǎng)基[CM）]

[FK（W2][TZTTtif][FK）]

的結(jié)果相似，進(jìn)入穩(wěn)定期酶活性增加速率則逐漸超過在基本培養(yǎng)基中速率，最高為9 200 U（圖2）。

[FK（W0][TZTT2tif][FK）]

B subtils（pEB-43-bgaB）在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，β-半乳糖苷酶活性與E coli DH5α（pEB-amy-bgaB）在在富營養(yǎng)培養(yǎng)基條件下相似，對數(shù)前期開始表現(xiàn)，隨著菌量增長活性迅速提高，穩(wěn)定期后逐步平穩(wěn)，最高可達(dá)9 550 U，在穩(wěn)定期后隨著菌群衰退酶活性下降（圖3）。

[FK（W0][TZTT3tif][FK）]

E coli DH5α（pEB-amy-bgaB）在添加%可溶性淀粉誘導(dǎo)條件下，β-半乳糖苷酶活性可達(dá) 000 U；而在添加%葡萄糖以及無誘導(dǎo)條件下酶活很低，最高只有30 U。B subtils（pEB-amy-bgaB）在無誘導(dǎo)條件下β-半乳糖苷酶活性略高（750 U）。

3討論

本研究通過檢測β-半乳糖苷酶活性，研究了啟動(dòng)子43及amy在B subtils和E coli中的轉(zhuǎn)錄活性。本研究發(fā)現(xiàn)43轉(zhuǎn)錄合成的β-半乳糖苷酶活性，在（pEB-43-bgaB）和（pEB-43-bgaB）中的結(jié)果相似，對數(shù)前期開始表現(xiàn)，隨著菌量增長活性迅速提高，穩(wěn)定期逐步平穩(wěn)，同樣在穩(wěn)定期后隨著菌群衰退，酶活性下降。在B subtils（pEB-43-bgaB）中β-半乳糖苷酶活性可達(dá)9 500 U以上。本研究結(jié)果與Ye等在質(zhì)粒pUB0基礎(chǔ)上，以枯草桿菌WB700為宿主菌，利用43啟動(dòng)子和果聚糖蔗糖酶信號肽，在普通培養(yǎng)條件下分泌表達(dá)葡萄球菌激酶的結(jié)果基本一致[6]。啟動(dòng)子43在E coli中，β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)錄的水平可達(dá)9 200 U，這可能是由于E coli RNA聚合酶σ70與B subtils σ43具有同源性[6-0]，能夠識別結(jié)合啟動(dòng)子43，使之在E coli中同樣能轉(zhuǎn)錄。因而可利用啟動(dòng)子43先在E coli中表達(dá)檢測外源基因，再轉(zhuǎn)入B subtils中表達(dá)。

序列分析比對發(fā)現(xiàn)43序列與σ43和σ37的識別序列并不完全保守，σ43和σ37識別序列的保守性顯然與啟動(dòng)子的高活性不相符。因而Wang等推測在σ43和σ37識別序列之外還存在其他能夠影響啟動(dòng)子活性的因素[8]。在本實(shí)驗(yàn)室，另一研究將啟動(dòng)子43的核糖體結(jié)合序列刪除后，替換上原核典型的核糖體結(jié)合序列，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄效率仍然較高，說明影響因素可能不是核糖體結(jié)合序列。

本研究發(fā)現(xiàn)不同營養(yǎng)條件可影響啟動(dòng)子43的轉(zhuǎn)錄活性。對數(shù)前期，在基本培養(yǎng)基和富營養(yǎng)條件下啟動(dòng)子43的轉(zhuǎn)錄活性差異不大；進(jìn)入穩(wěn)定期后，出現(xiàn)差距，43在基本培養(yǎng)基轉(zhuǎn)錄表達(dá)的β-半乳糖苷酶活性增長逐漸進(jìn)入了平穩(wěn)期，而富營養(yǎng)條件下其活性增長率依然很高，持續(xù)向上增長。這種差異可能由于啟動(dòng)子43轉(zhuǎn)錄效率較高與合成mRNA及蛋白質(zhì)原料有限之間的矛盾引起。對數(shù)前期及對數(shù)期，菌量小，營養(yǎng)充足，差異不明顯，進(jìn)入穩(wěn)定期后，隨著菌群擴(kuò)大及啟動(dòng)子43高效率轉(zhuǎn)錄，營養(yǎng)矛盾造成的差異逐步突出，因而優(yōu)化營養(yǎng)條件有助于提高啟動(dòng)子43的轉(zhuǎn)錄活性。

啟動(dòng)子amy在E coli中轉(zhuǎn)錄活性較低，β-半乳糖苷酶活性在誘導(dǎo)條件下最高為 000 U?；钚匀醯脑蚩赡苁请m然啟動(dòng)子amy也是由B subtils RNA聚合酶σ43識別轉(zhuǎn)錄，但對E coli的σ70因子親和性低，因而在E coli中轉(zhuǎn)錄水平低；另一原因也可能是攜帶α-淀粉酶的信號肽的β-半乳糖苷酶融合元，在E coli胞內(nèi)未能切除信號肽，以無活性的蛋白形式存在。啟動(dòng)子amy在B subtils中轉(zhuǎn)錄活性本身可能就不太高，Gat以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，利用B subtils WB600和pUB0衍生載體，發(fā)現(xiàn)amy活性較低。因此amy的序列還有待改造提高其活性。

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