羅愛國，馮 佳，胡變芳

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系，山西太原030031；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；3.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030619）

（編輯 楊樂中）

貫眾（Cyrtomiumfortunei）為蕨類藥用植物，含有多酚、鞣質(zhì)、萜類、多糖、黃酮、鞣質(zhì)揮發(fā)油等活性成分［1~6］，具有殺蟲、抗菌、抗腫瘤、抗病毒，促凝血、抗衰老等作用［7~12］，常以根莖入藥，用于清熱解毒、殺蟲、止血等功效，廣泛用于中藥、化妝保健、農(nóng)藥等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊［13］.總間苯三酚類化合物是貫眾主要活性成分之一，有驅(qū)蟲、抗腫瘤的功效.貫眾中活性成分含量不僅隨產(chǎn)地不同而有一定差異，同時(shí)不同提取條件對有效成分的影響也較大，直接影響藥用價(jià)值及其應(yīng)用效果.

目前貫眾的研究主要集中在藥理及化學(xué)成分等領(lǐng)域，對活性成分提取工藝研究不夠深入，貫眾藥材利用率較低.活性成分總間苯三酚類化合物（TBTPC）的提取大多采用回流提取、超聲提取、微波法提取等［14~16］，但大多提取效率低.本文以河北辛集市收集的商品貫眾（綿馬貫眾）為材料，考察回流提取工藝參數(shù)對貫眾TBTPC浸出率的影響，有效提高了活性成分TBTPC的提取率，為貫眾的準(zhǔn)確用藥及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定等提供了科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品（上海士鋒生物科技有限公司），無水乙醚、乙酸乙酯等均為分析純；材料：河北辛集市收集的商品貫眾（經(jīng)鑒定為綿馬貫眾）.

1.2 方法

1.2.1樣品制備

將藥材貫眾洗凈，室溫下陰干，粉碎為粒徑為0.45 mm的粉末.稱取10.00 g，加入一定體積的無水乙醚，加熱回流提取一定時(shí)間，提取液離心5 min（10000 r/min），上清液經(jīng)減壓濃縮成流浸膏，在3℃下冷藏析出黃褐色沉淀，經(jīng)真空抽濾，用無水乙醚洗滌沉淀，得黃色結(jié)晶性粉末，再用乙酸乙酯加熱溶解，繼續(xù)在3℃下冷析，濾過，得黃色結(jié)晶，80℃烘干，制得TBTPC樣品，稱重后放入棕色試劑瓶，在4℃冷藏備用.

1.2.2總間苯三酚類化合物的含量測定

含量測定參照高增平［14］的研究方法并稍加修改.精密稱取綿馬貫眾素ABBA適量0.500 0 g，加入適量95%乙醇溶解，定量稀釋成濃度為0.5 g/L的標(biāo)樣，分別取此標(biāo)樣為0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，加95%乙醇定容至100 mL，配制成不同濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液.同時(shí)精密移取樣品0.025 0 g，加入95%乙醇溶解定容到1 L，制成樣品溶液.

分別取不同濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL于10 mL具塞比色管中，加入5 mL堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液（0.5%），搖勻，室溫下靜置30 min，于476 nm下測定A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.按上述同樣步驟方法測定樣品溶液，得出TBTPC的含量.樣品測定試驗(yàn)重復(fù)三次.

1.2.3提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1單因素試驗(yàn)

按照1.2.1方法分別選取料液比（x1）、提取溫度（x2）、提取時(shí)間（x3）三個(gè)條件作為考察因素，進(jìn)行TBTPC提取試驗(yàn)，依1.2.2測定方法求得TBTPC含量，并計(jì)算提取率.試驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)平行測定三次，結(jié)果取平均值.提取條件參數(shù)范圍選定見表1-3.

表1 考察溶劑用量對TBTPC產(chǎn)率的提取條件表

表2 考察提取溫度對TBTPC產(chǎn)率的提取條件表

表3 考察提取時(shí)間對TBTPC產(chǎn)率的提取條件表

1.2.3.2提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)——響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素考察，對提取工藝參數(shù)料液比（x1）、提取溫度（x2）、提取時(shí)間（x3）進(jìn)行Central Composite設(shè)計(jì)，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取工藝，確定最佳提取條件.各因素范圍實(shí)際值及標(biāo)準(zhǔn)化值見表4.

注：其中r值在p=3、m0=6時(shí)查表為1.682

1.2.4最優(yōu)提取條件試驗(yàn)驗(yàn)證

按照1.2.1試驗(yàn)方法，溶劑用量、提取溫度、提取時(shí)間均取最優(yōu)值，回流提取貫眾中活性成分TBTPC，得出提取率.試驗(yàn)重復(fù)五次，每個(gè)重復(fù)平行測定三次，并與理論值比較.

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Design-Expert 7.0與origin 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，ANOVA方采用SPSS18.0進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1.無水乙醚溶劑用量對TBTPC提取率的影響見圖1-A，隨溶劑用量的增加，提取率不斷升高，當(dāng)溶劑用量為400 mL時(shí)，提取率為8.35%，之后趨于平緩，單因素方差分析表明溶劑用量400 mL與500 mL對TBTPC提取率影響無顯著差異（P>0.05），溶劑用量選用400 mL.

提取溫度對TBTPC提取率的影響見圖1-B，提取產(chǎn)率變化隨溫度升高呈先上升后緩慢下降趨勢，溫度的上升可有效加快分子運(yùn)動，使活性成分迅速溶解在溶劑乙醚，當(dāng)提取溫度為30℃時(shí)，TBTPC的提取率達(dá)到8.04%，當(dāng)提取溫度為40℃，提取率開始下降，可能由于較高的溫度在一定程度上會破壞TBTPC酚羥基結(jié)構(gòu)，所以，提取溫度選取30℃.

圖1-C表示TBTPC提取率隨提取時(shí)間的變化曲線，提取時(shí)間增加提取率呈上升趨勢，當(dāng)提取時(shí)間大于3 h，提取率的變化平緩，方差分析表明，提取時(shí)間為3h、4h及5h時(shí)，對貫眾的TBTPC提取率的影響無顯著差異（P>0.05）.考慮到節(jié)省提取時(shí)間，故選取3 h.

2.2 提取工藝最優(yōu)化

提取工藝響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，通過分析，建立回歸模型：y=－2.57895＋0.011895x1＋0.36736x2＋1.57927x3＋0.00002x1x2－0.00146x1x3－0.00988x2x3－0.00001x12－0.00508x22－0.11019x32，R2=0.9506.回歸模型方差分析結(jié)果見表6，模型的P<0.0001，失擬項(xiàng)的P>0.0001，方程擬合良好.分析可知提取工藝中，提取溫度（x1）對貫眾活性成分TBTPC提取率影響極其顯著（P=0.0058），同時(shí)溶劑用量（x2，P=0.0190）與提取時(shí)間（x3，P=0.0393）也具有顯著影響（P<0.05）.在交互作用中，只有溶劑用量與提取時(shí)間具有顯著影響（P<0.05）.

圖2提取工藝條件中溶劑用量、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素中，其中一因素為零水平值時(shí)，另外兩因素間交互作用對TBTPC提取率影響響應(yīng)曲面圖.由圖2-A可知，當(dāng)提取時(shí)間為3 h，貫眾TBTPC的提取率受溶劑用量的提取率的影響并不明顯，但隨提取溫度增加先升高后緩慢降低，對提取率影響較大；而圖2-B表明，當(dāng)提取溫度不變時(shí)，溶劑用量與提取時(shí)間的增加，增大了提取率；圖2-C可以看出，提取溶劑用量一定時(shí)，提取率隨提取溫度先升快速高后緩慢降低，隨提取時(shí)間延長而緩慢增加.結(jié)果表明再次因素提取溫度對TBTPC提取率的影響極顯著.

圖1 不同提取條件單因素對貫眾TBTPC提取率的影響

通過Design Expert 7.0對提取工藝條件最優(yōu)化，得出最優(yōu)條件為：溶劑用量500 ml（貫眾物料為10.0 g），提取溫度為36.12℃，提取時(shí)間為1 h，貫眾中TBTPC的提取率可達(dá)8.5961%.

表5 通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)點(diǎn)及結(jié)果

表6 回歸模型方差分析表

圖2 不同提取因素交互作用對TBTPC提取率的影響的3D響應(yīng)曲面

2.3最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

最優(yōu)條件下TBTPC提取率試驗(yàn)結(jié)果見表7.在最優(yōu)提取條件下，實(shí)測TBTPC提取率為8.570 5%（RSD=0.004 6%），與提取率理論值8.596 1%相比，接近程度達(dá)99.70%，驗(yàn)證了回歸模型得出的最優(yōu)條件與實(shí)際相符，回歸模型可靠.

表7 最優(yōu)提取條件下TBTPC提取率結(jié)果表

3 結(jié)論

本文主要通過響應(yīng)面法分析了加熱回流提取條件無水乙醚溶劑用量、提取溫度、提取時(shí)間對綿馬貫眾活性物質(zhì)TBTPC的顯著性影響分析，并優(yōu)化了提取工藝.三個(gè)因素對提取率影響的顯著性順序依次為：提取溫度>提取溶劑>提取時(shí)間，得出的最優(yōu)提取條件為提取溫度為36.12℃、溶劑用量為500 mL、提取時(shí)間為1 h，提取率可達(dá)8.5961%，經(jīng)驗(yàn)證回歸模型可靠.優(yōu)化后的提取工藝有效提高了貫眾活性成分TBTPC的提取率，同時(shí)很大程度上減少了回流提取時(shí)間，提取工藝簡單、快速、效果高.為貫眾的有效提取提供了可行的理論與實(shí)踐依據(jù)，提高了商品貫眾的利用率.

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