于 泳 司馬哲超

（東南大學成賢學院，江蘇南京210088）

0 引言

一般來說，在藥品質(zhì)量管理活動中，為了確保質(zhì)量控制的分析方法符合檢驗要求，滿足GMP的要求，并能讓客戶感到滿意，凡是涉及分析方法的領(lǐng)域都應(yīng)對其分析方法進行驗證。

1 問題的提出

國際人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議（ICH）在其質(zhì)量指導文件Q2a中將分析方法分為鑒別、定量分析、限度檢測與含量分析4種常見類型，每種類型及其典型的驗證參數(shù)如表1所示。其中，－表示通常不需要驗證的參數(shù)；+表示通常需要驗證的參數(shù)；①表示假如已論證重現(xiàn)性，可不需再論證中間精密度；②表示缺乏專屬性的分析方法，應(yīng)由其他分析方法來補充；③表示視具體情況而定。各類驗證參數(shù)定義如表2所示[1]。

表1 驗證類型與相應(yīng)參數(shù)

表2 驗證參數(shù)與表示方法

某藥品生產(chǎn)企業(yè)的主要產(chǎn)品為中藥心腦健片，其主要成分為茶葉提取物，根據(jù)2010版中國藥典，用紫外—可見分光光度法，在540 nm波長處測定吸光度。從檢測情況來看，所生產(chǎn)的片劑主藥含量符合標準，根據(jù)新版GMP的要求，必須對這個檢驗方法進行方法學驗證。

2 方法學驗證的實驗內(nèi)容

心腦健片的成分為茶葉提取物，為顯淡黃褐色至棕褐色的片劑。此次試驗對“20130301”和“20131001”2件批號的心腦健片樣品進行了驗證及研究[2]。

2.1 含量測定

實驗步驟：取本品20片，研細。精密稱取適量（約相當于茶葉提取物0.1 g），置100m L量瓶中，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1m L，置25m L量瓶中，加水4m L、酒石酸鐵溶液（去硫酸亞鐵1 g，酒石酸鉀鈉5 g，加水溶解并稀釋至1 000m L）5m L，搖勻；再加pH 7.5的磷酸鹽緩沖液［甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）23.377 g，用水溶解并稀釋至1 000m L，搖勻；乙液：稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.078 g，用水溶解并稀釋至1 000m L，搖勻。取甲液85m L與乙液15m L，混勻，搖勻，即得］至刻度，搖勻。以水為空白對照，照紫外—可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄VA），在540 nm波長處測定吸光度。

計算公式：

本品的含茶葉提取物以茶多酚計，為標示量的90.0%～110%（內(nèi)控為95%～105%）。取樣品重量為0.252 2 g、平均片重為0.273 99 g的心腦健片樣品，測出其540 nm處波長和含量如表3所示。

取樣品重量為0.270 8 g、平均片重為0.273 99 g的心腦健片樣品，其測出540 nm處波長和含量如表4所示。

表3 540 nm處波長和含量（樣品重量為0.252 2 g、平均片重為0.273 99 g）

表4 540 nm處波長和含量（樣品重量為0.270 8 g、平均片重為0.273 99 g）

實驗結(jié)論：經(jīng)過540 nm處波長測定，計算出的樣品的茶多酚含量為95.3%、97.4%，既滿足國家標準，也滿足內(nèi)控標準，為合格產(chǎn)品。

2.2 專屬性

鑒別試驗：取本品20片，研細。精密稱取適量（約相當于茶葉提取物0.1 g），加水100m L，攪拌，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2m L，滴加三氯化鐵1滴，濾液呈藍黑色。取上述剩余濾液2m L，滴加香草醛試液（臨時用配制）1m L，呈櫻紅色。結(jié)論：滴加三氯化鐵濾液呈藍黑色，滴加香草醛試液呈櫻紅色，主藥與輔料、雜質(zhì)等能明顯區(qū)分，表明其專屬性良好。

2.3 精密度

重復性測定實驗步驟：取本品20片，研細。精密稱取0.147 5 g，置100m L量瓶中，搖勻，濾過，棄去初濾液，重復精密量取續(xù)濾液1m L 3次，分別置于25 m L量瓶中，加水4 m L、酒石酸鐵溶液5 m L，搖勻，再加pH7.5的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，以水為空白對照，照紫外—可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄VA），每組在540 nm波長處測定3次，得到其吸光度，計算其含量和RSD（平均片重為0.291 8 g），其計算結(jié)果如表5所示。

表5 精密度測定結(jié)果（片重為0.291 8 g）

同上述實驗步驟，精密稱取0.254 3 g樣品，配置成上述溶液，于540 nm波長處測定其吸光度。其計算結(jié)果如表6所示。

表6 精密度測定結(jié)果（0.254 3 g樣品）

同上述實驗步驟，精密稱取1.252 3 g樣品，配置成上述溶液，于540 nm波長處測定其吸光度。計算結(jié)果如表7所示。

實驗結(jié)論：經(jīng)過對不同濃度的心腦健片在較短間隔內(nèi)的重復性測定，發(fā)現(xiàn)其相對標準偏差RSD為1.6%、0.5%、0.1%，RSD≤2%，滿足中國藥典對于紫外分光光度計的要求，表明其精密度良好。

2.4 線性

實驗步驟：取本品20片，研細。精密稱取0.2595g，置100m L量瓶中，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液，配置濃度為0.025mg/m L、0.05 mg/m L、0.2 mg/m L、0.25 mg/m L、0.4 mg/m L的供試品，之后再540 nm處測定其吸光度，構(gòu)建線性曲線，求出線性方程和R值，如表8所示[3]。

實驗結(jié)論：濃度與吸光度的線性關(guān)系如圖1所示，此次線性實驗所做的5個濃度均在線性范圍內(nèi)，其相關(guān)系數(shù)R2值為0.997 1，滿足線性關(guān)系，線性回歸方程為y=3.207 6x-0.019 2，且在含量測定中所

表7 精密度測定結(jié)果（1.252 3 g樣品）

表8 線性測定結(jié)果

做的2個含量值也在線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系[4]。

圖1 濃度與吸光度的線性關(guān)系

2.5 范圍

實驗步驟：取本品10片，研細，精密稱取10個樣品，分別置于100m L容量瓶中，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1m L，分別置于25m L容量瓶中，加水4 m L、酒石酸鐵溶液5 m L，搖勻，再加pH7.5的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，以水為空白對照，照紫外—可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄VA），每組在540 nm波長處測定3次，得到其吸光度。

計算其含量均值和標準差S，以及標示量與均值之差的絕對值A(chǔ)（A=|100-X|）。如A+1.80S≤15.0，即供試品的含量均勻度符合規(guī)定；若A+S＞15.0，則不符合規(guī)定；若A+1.80S＞15.0，且A+S≤15.0，則應(yīng)另取20片（個）復試。根據(jù)初、復試結(jié)果，計算30片（個）的均值X、標準差S和標示量與均值之差的絕對值A(chǔ)，如A+1.45S≤15.0，即供試品的含量均勻度符合規(guī)定；若A+1.45S＞15.0，則不符合規(guī)定。計算結(jié)果如表9所示[5]。

實驗結(jié)論：標準差S為2.089，絕對值A(chǔ)為2.5，A+1.80S≤15.0，供試品的含量均勻度符合藥典標準[6]。

表9 范圍測定結(jié)果

3 深入研究

為探究各個因素對心腦健片的影響，故設(shè)計三因素三水平的正交實驗對水溫、過濾方式及震蕩時間進行了測定，因素水平表如表10所示。

表10 因素水平表

實驗步驟：精密稱取1.248 8 g樣品，置于500m L的容量瓶中，加水，搖勻，分別精密量取3次100m L的樣品溶液，放入100m L容量瓶中，設(shè)水溫為A，過濾方式為B，震蕩時間為C，在不考慮交互作用的情況下，分別在540 nm處測定A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1、A3B3C2的波長，測定實驗結(jié)果如表11所示。L9（34）正交試驗結(jié)果效應(yīng)曲線如圖2所示。

實驗結(jié)論：根據(jù)表11的極差R值大小，可以看出因子2對試驗結(jié)果的影響最大，即過濾方式對試驗影響最大，而其中又以因子3離心過濾更加突出，之后是因子1水溫以37℃為最具影響，最后因子3震蕩時間中1 h最具影響。因此，可初步估計最優(yōu)方案為A2B3C2；再進一步分析，通過表11可以看出，3個因素一個都沒有超過F臨界值，即它們都不是顯著性因素，但是相對來說因子2的F值要大于因子1和因子3。所以，可以認為三者中最具顯著性的便是因素2過濾方式，根據(jù)圖2效應(yīng)曲線圖，很明顯因素1水溫到了一個點之后效應(yīng)便開始下降，因素3時間也是，只有因素2仍在緩慢上升，因此因素2過濾方式仍可繼續(xù)研究，提升工藝。通過分析，確定在此次的正交試驗中A2B3C2是最優(yōu)方案[7]。

表11 正交實驗測定結(jié)果

續(xù)表

圖2 L9（34）正交試驗結(jié)果效應(yīng)曲線圖

4 結(jié)語

上述方法表明，確認應(yīng)用此分析方法分析心腦健片含量、專屬性、精密度、線性、范圍指標都符合紫外-分光光度法的常規(guī)要求和藥典要求，因此該方法可以滿足心腦健片日常含量的測定要求。

［1］霍秀敏.化學藥物分析方法驗證的內(nèi)容和評價［J］.中國新藥雜志，2009（10）

［2］成海平.指導原則解讀系列專題（七）化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證的原則和要求［J］.中國新藥雜志，2009（8）

［3］覃淑芬.質(zhì)量標準分析方法驗證方案——以單硝酸異山梨酯注射液為例［J］.企業(yè)科技與發(fā)展（上半月），2013（6）

［4］柴逸峰，紀松崗，張國慶，等.2000年版中國藥典附錄XⅨA“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證”的探討［J］.中國藥品標準，2002（2）

［5］梁毅.歐美藥物進口注冊文件中的分析方法驗證［J］.醫(yī)藥工程設(shè)計，2007（5）

［6］ Taverniers I,De Loose M,Van Bockstaele E.Trends in qual ity in the analytical laboratory.II.Analyt ical method val idation and qual ity assurance［J］.TrAC Trends in Analytical Chemist ry，2004（8）

［7］陳斌.醋酸奧曲肽微球工藝優(yōu)化及其驗證［D］：［碩士學位論文］.吉林大學，2013