賈　　敏，張亦凡，張銀志，孫秀蘭，，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.陜西省漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西漢中723000；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方法研究進(jìn)展

賈敏1，張亦凡2，張銀志3，孫秀蘭1，3，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.陜西省漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西漢中723000；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

牛奶是八大食物致敏原之一，能引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。如何實(shí)現(xiàn)食物中牛奶過(guò)敏原的快速，準(zhǔn)確篩檢已成為食品安全領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。牛奶主要過(guò)敏原為酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，其檢測(cè)方法有電泳法、色譜法、酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（ELISA）、傳感器、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)（LC-MS/MS）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）等。本文就其檢測(cè)方法的原理和應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為食品中牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)提供技術(shù)方向，以便保障牛奶過(guò)敏患者的安全。

牛奶過(guò)敏原，檢測(cè)，酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)

食物過(guò)敏是一個(gè)全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有1%～2%成人和5%～8%兒童對(duì)某些食物存在過(guò)敏反應(yīng)［1］。牛奶過(guò)敏（CMA）是由于攝入乳或含有乳制品的食物而引起的異常免疫反應(yīng)，在兒童中（3歲以?xún)?nèi)）引起廣泛的不良反應(yīng)，其發(fā)病率高達(dá)7.5%［2］。近年來(lái)隨著乳及乳制品在人群中的消費(fèi)量不斷的增加，牛奶過(guò)敏率也在逐漸增加，牛奶過(guò)敏成為一個(gè)不容忽視的食品安全問(wèn)題。牛奶蛋白含量豐富，理論而言天然牛奶含有的任何一種蛋白質(zhì)都有潛在致敏性，但目前普遍認(rèn)為酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（beta-lactoglobulin，β-Lg）及α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-La）是主要的牛奶過(guò)敏原［3］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)牛奶過(guò)敏性疾病沒(méi)有徹底有效的根治方法，防止牛奶過(guò)敏的唯一有效手段是避免食入含有乳及乳制品的食物。為保護(hù)消費(fèi)者健康，美國(guó)及歐盟新食品標(biāo)簽法規(guī)定含有牛奶成分的食品必須標(biāo)示牛奶過(guò)敏原成分［4］，我國(guó)在各級(jí)食品標(biāo)準(zhǔn)中也做了相關(guān)的規(guī)定，《GB 7718-2011預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》及《GB/T 23779-2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分》［5-6］均對(duì)食品過(guò)敏原標(biāo)示有明確要求。因此為確保食品標(biāo)簽的準(zhǔn)確性和消費(fèi)者的安全，實(shí)現(xiàn)對(duì)食物過(guò)敏原的靈敏，可靠檢測(cè)至關(guān)重要。至今為止，對(duì)食物過(guò)敏原的檢測(cè)主要是基于蛋白和核酸水平的研究?；诘鞍椎膫鹘y(tǒng)檢測(cè)方法有電泳法、色譜法及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）及免疫傳感器等，但基于傳統(tǒng)的電泳法、色譜法及免疫學(xué)方法往往是針對(duì)單個(gè)蛋白進(jìn)行分析，其研究發(fā)展較為成熟但尚不足以滿(mǎn)足實(shí)際需要，而近年來(lái)基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的運(yùn)用，為實(shí)現(xiàn)對(duì)多種食品過(guò)敏原同時(shí)進(jìn)行高通量、高靈敏度的快速檢測(cè)提供了新的手段。利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法（LC-MS/MS）可直接對(duì)致敏性蛋白進(jìn)行檢測(cè)或?qū)⒌鞍捉?jīng)專(zhuān)一蛋白酶水解，在肽段水平間接實(shí)現(xiàn)過(guò)敏性蛋白的檢測(cè)。伴隨核酸快速檢測(cè)技術(shù)研究的發(fā)展，基于DNA的特異性檢測(cè)方法被引入食品過(guò)敏原成分的檢驗(yàn)，基于核酸的檢測(cè)方法主要有普通PCR、real-time PCR。

1　基于蛋白的傳統(tǒng)牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方法

1.1電泳法

電泳是帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)工作原理可分為：毛細(xì)管電泳、移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳等［7］。其中毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）在過(guò)敏原蛋白的分離檢測(cè)上應(yīng)用較為廣泛。毛細(xì)管電泳是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品各組分之間多種特性（電荷、大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、分配特性等）的不同而實(shí)現(xiàn)分離目的的一類(lèi)液相分離技術(shù)，具有高效、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、微量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)［8］。近年來(lái)，研究人員針對(duì)毛細(xì)管電泳在牛奶過(guò)敏蛋白的檢測(cè)做了深入研究。田蘭［9］選擇聚乙烯醇涂層毛細(xì)管，采用檸檬酸緩沖體系（pH3.0），在紫外檢測(cè)214nm、分離電壓20kV條件下對(duì)乳及乳制品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白進(jìn)行分離測(cè)定。結(jié)果顯示五種蛋白的線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9978，加標(biāo)回收率范圍為88.1%～110.8%。劉一［10］研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重現(xiàn)性好的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）方法，利用未涂層的熔融石英毛細(xì)管為分離柱，在電壓30kV，pH7.0的磷酸鹽緩沖液，毛細(xì)管溫度25℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)205nm的條件下，2min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的基線(xiàn)分離和痕量檢測(cè)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化有效解決了兩種蛋白在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的高效分離和高靈敏檢測(cè)。兩種蛋白的檢出限分別為3、12mg/L；線(xiàn)性范圍為10～250、40～1000mg/L。

1.2色譜法

高 效 液相 色 譜（highperformanceliquid chromatography，HPLC）是一種基于樣品分子在固相（即柱填料）和流動(dòng)相（即淋洗液）之間的相互作用而實(shí)現(xiàn)分離的一種快速、高效的新型分析技術(shù)。因其具有高效、選擇性好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)物質(zhì)快速分離和分析的重要手段。食物過(guò)敏蛋白的檢測(cè)主要為反相高效色譜法（RP-HPLC），RP-HPLC是流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法，應(yīng)用范圍廣泛，普遍適用非極性和弱極性物質(zhì)的分離。

目前，RP-HPLC分析乳清蛋白在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究。朱宏［11］建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的RP-HPLC法同時(shí)定量檢測(cè)乳清蛋白中牛乳鐵蛋、轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。采用Proteonavi C4色譜柱（5μm，250μm×46μm），流動(dòng)相A為0.1%的三氟乙酸-水溶液，B為乙腈水溶液，梯度洗脫：流動(dòng)相B最初為18%，在15min內(nèi)從上升到43%，保持5min，10min升至75%，在最后15min內(nèi)降到18%，流速為0.5mL/min，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫35℃。結(jié)果顯示5種蛋白都可以在優(yōu)化的色譜條件上實(shí)現(xiàn)較好的分離，采用外標(biāo)法定量，線(xiàn)性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。Ferreira［12］采用RP-HPLC法對(duì)牛，綿羊，山羊中的β-乳球蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，流動(dòng)相同樣為三氟乙酸的水溶液和乙腈水溶液。

1.3ELISA

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是以酶作為標(biāo)記物，以抗原和抗體之間免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。它是在免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，最早出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，具有操作簡(jiǎn)單、處理樣品量大、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)階段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品安全質(zhì)量的快速篩查，并取得較好的效果。目前，應(yīng)用于牛奶過(guò)敏原的ELISA檢測(cè)方式主要有雙抗體夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA兩種。ELISA在牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方面對(duì)象有所差異，僅限用于單一致敏蛋白的檢測(cè)或總蛋白的檢測(cè)。布冠好［13］在制備β-Lg多克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了定量檢測(cè)牛乳β-Lg的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，檢測(cè)范圍在0.05～1μg/mL之間，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基于β-Lg的競(jìng)爭(zhēng)ELISA具有較好的重現(xiàn)性。酶聯(lián)免疫技術(shù)的特異性和靈敏度取決于抗體的特異性和效價(jià)，相對(duì)而言單克隆抗體的特異性較好，多克隆抗體的靈敏度較高。王碩［14］通過(guò)包被鼠抗酪蛋白單克隆抗體，HRP標(biāo)記兔抗酪蛋白多克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)牛奶過(guò)敏原酪蛋白。檢測(cè)線(xiàn)性范圍為6～1666ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9949，最低檢測(cè)限為7ng/mL，可計(jì)算出來(lái)牛乳中酪蛋白含量。肖海龍等［15］通過(guò)單抗和多抗的組合建立了定性檢測(cè)牛奶β-酪蛋白的雙抗夾心ELISA方法，最低檢測(cè)限為15ng/mL且與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好。食品工業(yè)原料比較復(fù)雜，因此實(shí)際樣品ELISA檢測(cè)往往受到食物復(fù)雜的生物基質(zhì)影響?；诖薓onaci［16］以餅干為食物模型，研究了焙烤時(shí)間和基質(zhì)效應(yīng)對(duì)ELISA檢測(cè)牛奶過(guò)敏原的影響。

ELISA技術(shù)較為成熟，目前市場(chǎng)上已有多種針對(duì)牛奶過(guò)敏原定性或定量檢測(cè)的商業(yè)試劑盒，如Neogen、R-biopharm、Elisa Systems、WAKO等，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)牛奶過(guò)敏原的定性或半定量檢測(cè)。WAKO的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)限為0.05μg/mL，最低定量限為0.04μg/mL，回收率在79%～122%之間。NH HAM公司牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒測(cè)定范圍在0.78～50ng/mL，靈敏度達(dá)到0.78ng/mL，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)原材料食品和加工食品中的牛奶過(guò)敏原蛋白質(zhì)。張海英等［17］對(duì)市售兩種β-乳球蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了比較，得出兩種試劑盒對(duì)β-乳球蛋白檢測(cè)的回收率，精密度均可達(dá)到ELISA檢測(cè)技術(shù)要求，R-biopharm試劑盒特異性較高僅可檢測(cè)牛奶中β-乳球蛋白含量，Elisa Systems試劑盒針對(duì)哺乳動(dòng)物乳汁（牛、羊等中的β-乳球蛋白），不能特異性識(shí)別牛奶中的β-乳球蛋白。張霞［18］對(duì)市面上三種酪蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，Elisa Systems試劑盒對(duì)羊奶酪蛋白檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，Neogen和R-biopharm試劑盒均可特異性檢測(cè)牛奶酪蛋白成分。

1.4生物免疫傳感器

生物傳感器利用生物活性物質(zhì)的分子識(shí)別功能，將其識(shí)別待檢物質(zhì)所引起的化學(xué)或物理變化，借助轉(zhuǎn)換器變換成電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目的物質(zhì)的檢測(cè)。識(shí)別原件可為蛋白、細(xì)胞、DNA等生物大分子，其特點(diǎn)是自動(dòng)化程度高、成本低、準(zhǔn)確敏感，能在數(shù)分鐘內(nèi)出結(jié)果，非專(zhuān)業(yè)人員即可使用，無(wú)需培訓(xùn)。目前已經(jīng)逐漸應(yīng)用于食品安全分析。免疫傳感器是目前應(yīng)用最為廣泛，發(fā)展最為成熟的一種生物傳感器。免疫傳感器是以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)在電極上固定抗原/抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體/抗原的檢測(cè)。目前已經(jīng)有技術(shù)人員將免疫傳感器應(yīng)用于牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)：王玲玲［19］在玻碳電極表面修飾石墨烯和殼聚糖的復(fù)合物，通過(guò)納米金對(duì)抗體的親和力將其固定到電極表面制成免疫傳感器。在10～1000μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)限為2μg/L。Eissa［20］在絲網(wǎng)印刷碳電極表面修飾石墨烯有機(jī)膜，利用石墨烯表面的氨基團(tuán)和β-乳球蛋白抗體之間的共價(jià)結(jié)合將抗體固定到電極表面，利用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行免疫傳感器電化學(xué)行為表征，差分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行線(xiàn)性分析。免疫傳感器的線(xiàn)性檢測(cè)范圍為1～100pg/mL，檢測(cè)限為0.85pg/mL，并能特異區(qū)分卵清蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、溶菌酶。與ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示ELISA和免疫傳感器檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性，進(jìn)一步表明研制的免疫傳感器可用于實(shí)際樣品中β-乳球蛋白的檢測(cè)。

2　基于蛋白質(zhì)組學(xué)的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方法

目前廣泛應(yīng)用于過(guò)敏原檢測(cè)的方法主要是ELISA，直接檢測(cè)致敏性蛋白，只能針對(duì)單個(gè)蛋白，存在特異性差，線(xiàn)性范圍窄等缺點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上依靠質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸應(yīng)用發(fā)展起來(lái)，可用于多個(gè)蛋白的定性或定量分析，具有高靈敏度、高分辨率、高準(zhǔn)確度、高通量等特點(diǎn)［21-22］。

蛋白質(zhì)組學(xué)旨在鑒定出一個(gè)細(xì)胞組織或器官中全部蛋白組成質(zhì)量和數(shù)量的信息，質(zhì)譜作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一項(xiàng)強(qiáng)有力的工具日趨成熟并發(fā)揮著核心作用［23］。為提高準(zhǔn)確性質(zhì)譜技術(shù)常與色譜技術(shù)聯(lián)用（LC-MS/MS），將色譜的分離能力和質(zhì)譜的選擇能力結(jié)合起來(lái)，減少相似結(jié)構(gòu)性質(zhì)的蛋白質(zhì)和多肽的干擾，特異性更高，避免了樣品基質(zhì)的干擾，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定性或定量分析。在過(guò)敏原蛋白檢測(cè)上，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品中花生［24］、大豆［25］、牛奶雞蛋［26］過(guò)敏原的定性、定量檢測(cè)。如何從大規(guī)模質(zhì)譜數(shù)據(jù)中得出蛋白質(zhì)表達(dá)水平即蛋白質(zhì)定量信息一直是蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是在整體水平上研究蛋白質(zhì)的定量分析，是通過(guò)比較多個(gè)樣品質(zhì)譜相關(guān)信息的豐度變化進(jìn)行定量［27］。定量蛋白質(zhì)組學(xué)有基于蛋白質(zhì)本身進(jìn)行的定量或肽段水平的定量。

2.1蛋白水平的定量分析

蛋白水平的定量分析，被分析物是蛋白本身，在蛋白分子量較小的情況下，蛋白直接經(jīng)過(guò)質(zhì)譜儀得到蛋白譜圖。由于食物蛋白譜圖并不復(fù)雜，因此可以利用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。Monaci等［28］利用液相色譜質(zhì)譜連用法對(duì)果汁中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白（A和B）進(jìn)行定量檢測(cè)。利用固相萃取進(jìn)行果汁樣品前處理，液相色譜采用C5色譜柱，流動(dòng)相A為5%乙腈水+0.1%甲酸，流動(dòng)相B為95%乙腈水+0.1%甲酸，梯度洗脫，流速為0.25mL/min，柱溫45℃。質(zhì)譜系統(tǒng)由配備有大氣壓負(fù)離子源的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀組成，采用多離子監(jiān)測(cè)方式（MIM）進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示建立的LC-MS（MIM）方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)三種乳清蛋白的同時(shí)檢測(cè)，線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995，檢測(cè)范圍為5～40μg/mL，檢測(cè)限達(dá)到1μg/mL（S/N=3），定量限為4μg/mL（S/N＞10），將建立的方法應(yīng)用于市售15種混合果汁的乳清蛋白檢測(cè)，取得較為滿(mǎn)意的結(jié)果。Czerwenka等［29］以山羊和羚羊β-乳球蛋白為內(nèi)標(biāo)，采用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)牛奶中的β-乳球蛋白（A和B）進(jìn)行了絕對(duì)定量。

2.2肽段水平的定量分析

蛋白經(jīng)專(zhuān)一蛋白酶水解，可在肽段水平上間接實(shí)現(xiàn)蛋白的定量。利用蛋白的鑒定技術(shù)，對(duì)致敏蛋白胰蛋白酶水解后得到的肽混合物進(jìn)行分析，從分析得到的肽段中選擇即具有特異性，又有良好的穩(wěn)定性和較高靈敏度的特征肽段（標(biāo)簽肽，Signature peptide）進(jìn)行蛋白檢測(cè)［30］。蛋白質(zhì)組學(xué)在過(guò)敏原檢測(cè)初期研究主要用于定性檢測(cè)。Monaci［31］研究選擇了酪蛋白（αs1、αs2、β、κ）的特異性肽段，以選擇的肽段表征過(guò)敏原的存在，并對(duì)葡萄酒中的酪蛋白過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。Weber［32］以液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（LC-Q-TOF）對(duì)αs1酪蛋白酶解后肽段進(jìn)行分析，選擇了兩個(gè)特異性肽段，應(yīng)用到其他食品酪蛋白過(guò)敏原的檢測(cè)。Ansariyi［33］對(duì)反芻類(lèi)動(dòng)物乳汁中四種牛奶過(guò)敏蛋白（α-CN，β-CN，α-La，β-Lg）的標(biāo)簽肽進(jìn)行分析選擇，實(shí)現(xiàn)四種蛋白的同步檢測(cè)。

基于肽段的定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要分為兩類(lèi)：同位素標(biāo)記定量技術(shù)和無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)?；跇?biāo)記定量可獲得較高的準(zhǔn)確度，使用同位素標(biāo)記合成的定量標(biāo)簽肽段作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行蛋白質(zhì)絕對(duì)定量已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。其原理是基于標(biāo)簽肽和同位素標(biāo)記合成內(nèi)標(biāo)肽之間的分子量差異，通過(guò)檢測(cè)定量標(biāo)簽肽和內(nèi)標(biāo)肽的信號(hào)強(qiáng)度比值進(jìn)行定量分析。雖然同位素標(biāo)記定量準(zhǔn)確度較好，但其成本較高，技術(shù)難度較大。目前也有研究發(fā)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記定量方法與標(biāo)記定量方法可達(dá)到相似的準(zhǔn)確度，無(wú)標(biāo)記定量主要是采用氨基酸序列相似的肽段作為內(nèi)標(biāo)。唐等［34］對(duì)同位素內(nèi)標(biāo)和無(wú)同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，利用LC-MS/ MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Mulitple Reaction Monitoring，MRM）對(duì)人腫瘤細(xì)胞和組織中的NQO1蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量，結(jié)果表明非同位素內(nèi)標(biāo)取得和同位素標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果具有很好的相關(guān)性，可以作為現(xiàn)今研究較為接受的同位素標(biāo)記定量方法的補(bǔ)充替換。李盈淳［35］也利用設(shè)計(jì)合成的肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的定量，線(xiàn)性關(guān)系良好（R2=0.9993），檢測(cè)范圍為2.2～112.3pmol/mL。肽段水平的牛奶過(guò)敏蛋白定量檢測(cè)已有報(bào)道，但尚處于起步階段，研究較少。馮小燕［36］利用LC-MS/MS對(duì)牛奶過(guò)敏原α-酪蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以O(shè)VA特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，在0.5～250mg/L范圍內(nèi)有較好線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限達(dá)到0.5mg/L，從奶粉、餅干、蛋黃派夾心及表面中分別檢測(cè)到2092.38、104.91、74.50、14.83μg/g酪蛋白。

3　基于核酸的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是以DNA/RNA為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)高溫變性、低溫退火及中溫延伸等三步環(huán)節(jié)組成一個(gè)循環(huán)周期，達(dá)到目的基因特異性擴(kuò)增的目的。目前PCR技術(shù)已經(jīng)逐漸取代ELISA技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的主流檢測(cè)方法，市面上也逐漸出現(xiàn)商業(yè)化的PCR檢測(cè)試劑盒。PCR技術(shù)分為普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種。普通PCR技術(shù)主要用于定性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果需電泳驗(yàn)證，容易受交叉污染產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，它具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、PCR污染少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需電泳驗(yàn)證可實(shí)現(xiàn)目的基因的定量分析。關(guān)瀟［37］，許慶金［38］分別建立了牛奶α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的定性PCR檢測(cè)技術(shù)，為實(shí)際樣品中的牛奶過(guò)敏原DNA的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。目前還沒(méi)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)報(bào)道，但它將是檢測(cè)牛奶過(guò)敏原的一個(gè)具有前瞻性的發(fā)展方向。

與基于蛋白的免疫學(xué)方法相比，PCR技術(shù)的特異性引物與靶基因?qū)Ｒ唤Y(jié)合而與其他相似序列無(wú)法結(jié)合，特異性較高可以克服交叉反應(yīng)的影響，避免對(duì)單一特異性抗體的需求。且DNA較蛋白相對(duì)穩(wěn)定，在食品加工過(guò)程中蛋白容易受酶、溫度、壓力的影響而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，使得致敏性蛋白容易檢測(cè)不出來(lái)，DNA比較穩(wěn)定，即使蛋白被破壞也可以提取出來(lái)DNA，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。因此PCR技術(shù)可以作為傳統(tǒng)的基于蛋白的補(bǔ)充方法，對(duì)食品中的潛在致敏原進(jìn)行快速檢測(cè)。

4　結(jié)語(yǔ)

牛奶可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富在食品中廣泛存在，且在人群消費(fèi)量中占很大比重，其引起的過(guò)敏問(wèn)題已引起了全世界范圍的關(guān)注。因此為維護(hù)食品安全和保護(hù)消費(fèi)者健康，迫切需要建立快速、準(zhǔn)確、高通量的牛奶過(guò)敏原體外檢測(cè)方法。目前應(yīng)用最廣泛的過(guò)敏原檢測(cè)方法主要是基于蛋白的傳統(tǒng)ELISA方法和基于基因的PCR方法。ELISA方法直接檢測(cè)致敏蛋白，是目前應(yīng)用最為成熟的可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法。但ELISA方法具有較低復(fù)雜度的特異性蛋白識(shí)別位點(diǎn)，蛋白被食品中復(fù)雜的生物基質(zhì)掩蓋導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。蛋白在加工過(guò)程易變性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陰性，且ELISA實(shí)驗(yàn)只針對(duì)單一蛋白的檢測(cè)。基于核酸的PCR技術(shù)相對(duì)免疫學(xué)方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但是PCR檢測(cè)的是DNA而非致敏性蛋白，檢測(cè)的結(jié)果不能真正說(shuō)明食物的致敏性。在此基礎(chǔ)上需要建立一種準(zhǔn)確、特異、高通量的檢測(cè)過(guò)敏原的方法?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的LC-MS/MS為這一目標(biāo)開(kāi)辟了新的道路。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法具有高靈敏、高通量、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)食物中的多種過(guò)敏蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)?？稍诘鞍姿胶碗亩嗡綄?shí)現(xiàn)蛋白的定量，且有報(bào)道說(shuō)明若選擇的肽段與致敏原表位重合，可進(jìn)一步說(shuō)明食物的致敏性［39］?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于過(guò)敏蛋白的定量尚處于研究階段，還有很多不足需要改進(jìn)，但定量蛋白質(zhì)組學(xué)在過(guò)敏原的檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

雖然已有多種方法應(yīng)用于牛奶過(guò)敏原檢測(cè)在一定程度上能夠滿(mǎn)足靈敏度和準(zhǔn)確性的要求。但是綜合考慮靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、樣品量、經(jīng)濟(jì)成本等因素，目前還沒(méi)有一種方法能夠滿(mǎn)足多樣化的實(shí)際樣品檢測(cè)要求，但隨著研究進(jìn)行，檢測(cè)方法也在被不斷的改進(jìn)，其靈敏度和準(zhǔn)確度得到了進(jìn)一步的提高。并且隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得過(guò)敏原的檢測(cè)向高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量、操作簡(jiǎn)單方向發(fā)展，為我國(guó)食品過(guò)敏原的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

［1］RE Poms，CL Klein，E Anklam.Methods for allergen analysis in food：a review［J］.Food Additives and Contaminants，2004，21（1）：1-31.

［2］Arjon J van Hengel.Food allergen detection methods and the challenge to protect food-allergic consumers［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，389（1）：111-118.

［3］Linda Monaci，Virginie Tregoat，Arjon J van Hengel，et al. Milk allergens，their characteristics and their detection in food：a review［J］.European Food Research and Technology，2006，223（2）：149-179.

［4］SAMUEL BENREJEB Godefroy，BERT Popping.International regulatory environment for food allergen labelling［J］.Molecular Biological and Immunological Techniques and Applications for Food Chemists，2009：267-292.

［5］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 7718-2011預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［6］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 23779-2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［7］陶俊鈺.電泳技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用［J］.安徽醫(yī)藥，2005，9（2）：125-126.

［8］Paul D Grossman，Joel C Colburn.Capillary electrophoresis：Theory and practice［M］.Academic Press，1992.

［9］田蘭，陳春麗，馬曉麗，等.毛細(xì)管電泳法對(duì)乳及乳制品中乳源蛋白的測(cè)定［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2013，34（4）：81-84.

［10］劉一，廖一平，白玉，等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳高效分離和高靈敏檢測(cè)α-乳清蛋白和β-乳球蛋白［J］.分析化學(xué)，2013，41（10）：1597-1600.

［11］朱宏，邢志恩，戴蘊(yùn)青，等.反相高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)多種乳清蛋白成分［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，17（3）：127-130.

［12］Isabel MPLVO Ferreira，Helena Ca?ote.Detection and quantification of bovine，ovine and caprine milk percentages in protected denomination of origin cheeses by reversed-phase high-performance liquid chromatography of beta-lactoglobulins［J］.Journal of Chromatography A，2003，1015（1）：111-118.

［13］布冠好，鄭喆，鄭海，等.牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，13（6）：71-76.

［14］王碩，楊澤琳，馬冬月，等.雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)牛乳中酪蛋白方法的建立［J］.食品科技，2010，35（9）：290-293.

［15］肖海，龍倡，趙凱，等.牛奶β-酪蛋白和大豆β-伴球蛋白雙抗制備及夾心ELISA快速定性檢測(cè)技術(shù)的建立［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2013，39（2）：222-226.

［16］Linda Monaci，Marcel Brohée，Virginie Tregoat，et al. Influence of baking time and matrix effects on the detection of milk allergens in cookie model food system by ELISA［J］.Food Chemistry，2011，127（2）：669-675.

［17］張海英，劉旸，吳冬雪，等.食品中β-乳球蛋白過(guò)敏原檢測(cè)方法的比較［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3（4）：295-299.

［18］張霞，吳冬雪，劉國(guó)紅，等.食品中酪蛋白過(guò)敏原檢測(cè)方法的比較［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3（4）：290-294.

［19］王玲玲，余晟，余萌.基于石墨烯-殼聚糖/納米金的酪蛋白電化學(xué)免疫傳感器［J］.信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，25（2）：229-232.

［20］Shimaa Eissa，Chaker Tlili，Lamia L’Hocine，et al. Electrochemicalimmunosensorforthemilkallergenβlactoglobulin based on electrografting of organic film on graphene modified screen-printed carbon electrodes［J］.Biosensors and Bioelectronics，2012，38（1）：308-313.

［21］Sophie Fouchécourt，Sonia Métayer，Alain Locatelli，et al. Stallion epididymal fluid proteome：qualitative and quantitative characterization；secretion and dynamic changes of major proteins［J］.Biology of Reproduction，2000，62（6）：1790-1803.

［22］Linda Monaci，Angelo Visconti.Mass spectrometry-based proteomics methods for analysis of food allergens［J］.TrAC Trends in Analytical Chemistry，2009，28（5）：581-591.

［23］Pierre Thibault，John Marshall.Proteomics：From protein structures to clinical applications［J］.Journal of Proteomics，2013，81（9）：1-2.

［24］M Careri，A Costa，L Elviri，et al.Use of specific peptide biomarkers for quantitative confirmation of hidden allergenic peanut proteins Ara h 2 and Ara h 3/4 for food control by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，389（6）：1901-1907.

［25］Norma L Houston，Dong-Gi Lee，Severin E Stevenson，et al. Quantitation of soybean allergens using tandem mass spectrometry［J］.Journal of Proteome Research，2010，10（2）：763-773.

［26］Serena Tolin，Gabriella Pasini，Barbara Simonato，et al. Analysis of commercial wines by LC-MS/MS reveals the presence of residual milk and egg white allergens［J］.Food Control，2012， 28（2）：321-326.

［27］ErolEGulcicek，KennethRWilliams.Quantitative proteomics［J］.Methods，2013，61（3）：183-185.

［28］Linda Monaci，Arjon J van Hengel.Development of a method for the quantification of whey allergen traces in mixed-fruit juices based on liquid chromatography with mass spectrometric detection［J］.Journal of Chromatography A，2008，1192（1）：113-120.

［29］Christoph Czerwenka，Irene Maier，Natascha Potocnik，et al. Absolute quantitation of β-lactoglobulin by protein liquid chromatography-mass spectrometry and its application to different milk products［J］.Analytical Chemistry，2007，79（14）：5165-5172.

［30］Linda Monaci，J?rgen V N?rgaard，Arjon J van Hengel. Feasibility of a capillary LC/ESI-Q-TOF MS method for the detection of milk allergens in an incurred model food matrix［J］. Analytical Methods，2010，2（7）：967-972.

［31］L Monaci，I Losito，F(xiàn) Palmisano，et al.Identification of allergenic milk proteins markers in fined white wines by capillary liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（26）：4300-4305.

［32］Dorcas Weber，Philippe Raymond，Samuel Ben-Rejeb，et al. Developmentofaliquidchromatography-tandemmass spectrometry method using capillary liquid chromatography and nanoelectrospray ionization-quadrupole time-of-flight hybrid mass spectrometer for the detection of milk allergens［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（5）：1604-1610.

［33］Parisa Ansari，Norbert Stoppacher，Judith Rudolf，et al. Selection of possible marker peptides for the detection of major ruminant milk proteins in food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，399（3）：1105-1115.

［34］Zhiyuan Tang，Mengqiu Wu，Yingchun Li，et al.Absolute quantification of NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1 in human tumor cell lines and tissues by liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry using both isotopic and nonisotopic internal standards［J］.Analytica Chimica Acta，2013，772：59-67.

［35］李盈淳，湯志遠(yuǎn)，吳夢(mèng)秋，等.細(xì)胞內(nèi)p53蛋白LC-MS/MS定量方法及其應(yīng)用［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（6）：519-525.

［36］馮小燕，張津，呂美玲，等.利用液相色譜-質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法測(cè)定食物中主要的牛奶過(guò)敏原α-酪蛋白［J］.色譜，2013，31（6）：510-513.

［37］關(guān)瀟，蔡琴，陳沁.基于α-乳白蛋白基因序列的牛奶過(guò)敏原PCR檢測(cè)［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2013，36（4）：19-22.

［38］許慶金，鄧志瑞，張文舉，等.牛奶過(guò)敏原PCR監(jiān)測(cè)方法的建立［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（6）：104-107.

［39］Hubert Chassaigne，J?rgen V N?rgaard，Arjon J van Hengel. Proteomics-basedapproachtodetectandidentifymajor allergens in processed peanuts by capillary LC-Q-TOF（MS/MS）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（11）：4461-4473.

Research progress of milk allergen detection

JIA Min1，ZHANG Yi-fan2，ZHANG Yin-zhi3，SUN Xiu-lan1，3，*
（1.School of Food Science of Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Hanzhong Products Quality Supervison and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

Milk is recognized as one of the major food allergens，which could cause severe allergic reactions. The rapid and accurate detection of milk allergen have gained tremendous attention in the field of food safety. The major allergens in milk include casein（CN），beta-lactoglobulin（α-Lg）and alpha-lactalbumin（β-La）.The currently available detection method include electrophoresis chromatography，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），biosensor，proteomics based on mass spectrometry（LC-MS/MS）and polymerase chain reaction（PCR）.In this article，the principles and applications of major detection methods for milk allergens were summarized，which will provide guidance for the milk allergen detection in different food sources and the ensure of food safety for human health.

milk allergen；detection；ELISA；PCR；LC-MS/MS

TS252.7

A

1002-0306（2015）12-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.073

2014－09－23

賈敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測(cè)。

孫秀蘭（1976-），女，博士，教授，主要從事食品安全檢測(cè)方面的研究。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAK10B03）。