楊璐，依麗米努爾，朱苗苗，李宏*

(1.新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830002;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

硫是植物生長(zhǎng)必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，是繼氮、磷、鉀之后第四位植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素［1］，幾乎所有蛋白質(zhì)都有含硫氨基酸，因此硫在植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中都有著重要作用。硫不僅是蛋白質(zhì)和氨基酸的組成成分，而且參與許多酶、輔酶和硫胺類(lèi)等生理活性物質(zhì)的組成，參與有氧呼吸作用、氮素代謝、脂肪代謝、淀粉合成和生物固氮作用等重要生理生化過(guò)程［2］。研究表明，硫能促進(jìn)豆科作物形成根瘤，參與固氮酶的形成［3］;硫元素能提高氨基酸、蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而提升農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)［4］。同時(shí)，植物對(duì)一定濃度范圍內(nèi)的大氣污染物不僅具有一定程度的抵抗力，而且具有一定程度的吸收凈化能力，通過(guò)植物葉片中的含硫量檢測(cè)大氣環(huán)境中二氧化硫的濃度［5-7］。因此，硫的測(cè)定對(duì)于環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)的研究均有重要意義。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)硫酸鋇比濁法測(cè)定植物葉片中的硫含量進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，旨在建立一種簡(jiǎn)便、快捷測(cè)定植物葉片中硫含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Na2SO4、BaCl2均為優(yōu)級(jí)純;Na2CO3、硝酸、鹽酸、甘油、無(wú)水乙醇、丙酮、吐溫80 均為分析純。

UV-2600 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì);F6020C-33-80 馬弗爐;DHG-9053A 烘箱;C-MAG HP10 電熱板;TW20 水浴鍋;C-MAG HS4 磁力攪拌器;TP-214 萬(wàn)分之一天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 對(duì)從現(xiàn)場(chǎng)采集的新鮮植物葉片樣品立即用自來(lái)水洗2 ～3 次，去除葉面塵埃及附著物，再用去離子水沖洗2 次，自然晾干后置于鼓風(fēng)干燥箱中在70 ℃下烘30 min，然后105 ℃下烘至恒重。將烘干的樣品用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 ～80 mm 篩孔，得到粉末狀樣品，備用。

樣品處理參考吳名劍等［8］的方法，略有改動(dòng)。精確稱(chēng)取適量樣品1.000 g 于瓷坩堝中，加入2 mL 5% Na2CO3溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溫度300 ℃烘干至完全炭化，然后移入馬弗爐中先調(diào)節(jié)溫度300 ℃1 h 后逐步升溫至600 ℃，灰化2 h 后取出，冷卻后加入10 mL 2%鹽酸，電熱板100 ℃加熱20 min，過(guò)濾，濾液至于25 mL 容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.2 樣品測(cè)定 取2 mL 供試品溶液，置于25 mL 容量瓶中，加入2 mL 甘油-乙醇(1 ∶1)保護(hù)劑，加入少量去離子水稀釋?zhuān)瑩u勻，加入10 mg/mL BaCl2溶液2 mL，再加入25% HCl 溶液2 mL，用去離子水稀釋至刻度，搖勻后靜置3 min，倒入1 cm 石英比色皿中，以試劑空白作參比，在波長(zhǎng)470 nm 下測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中的硫含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

取樣品濃度16 μg/mL 的硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法在200 ～600 nm 進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，其吸收曲線(xiàn)顯示，在450 ～475 nm 該體系吸收值較穩(wěn)定，在470 nm波長(zhǎng)處體系有最大吸收峰，故實(shí)驗(yàn)選擇470 nm 為測(cè)量波長(zhǎng)。

2.2 加入不同酸的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，分三組，a 組不加任何酸，b 組加HCl(體積比1 ∶3)1 mL、c 組加HNO3(體積比1 ∶3)1 mL，按文獻(xiàn)方法，以相應(yīng)的試劑空白作參比，測(cè)定吸光度值觀(guān)察30 min，每5 min 記錄1 次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，不加酸的一組測(cè)定的吸光度不穩(wěn)定，忽高忽低，變異系數(shù)為9.2%。加酸的兩組吸光度均較為穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。加HCl組吸收值比加HNO3組的吸光度值大，且較穩(wěn)定，因此，選擇在比色體系中加入HCl。

溶液酸度的高低即是H+濃度的高低，它對(duì)沉淀反應(yīng)有一定的影響［9］，當(dāng)溶液中酸度較低或較高時(shí)均會(huì)影響吸光度的穩(wěn)定性，需在合適的酸度范圍內(nèi)進(jìn)行沉淀反應(yīng)，才能使形成的懸濁液測(cè)得的吸光度高而穩(wěn)定［6，10］。進(jìn)一步對(duì)HCl(體積比1 ∶3)用量進(jìn)行考察。取硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.50，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 的HCl(體積比1 ∶3)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法，以相應(yīng)的試劑空白作參比，測(cè)定吸光度見(jiàn)圖2。

圖1 加入不同酸的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.1 The stability test of different acid

圖2 鹽酸用量對(duì)吸光度的影響Fig.2 The influence on the absorbance of different amount of hydrochloric acid

由圖2 可知，當(dāng)鹽酸(體積比1 ∶3)加入量為2 mL 時(shí)吸光度值最高。

2.3 膠體保護(hù)劑的選擇

2.3.1 不加任何膠體保護(hù)劑時(shí)不同SO2－4 濃度的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取0.00，1.00，3.00，4.00，5.00，6.00，8.00 mL 硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，至25 mL 容量瓶中，用文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法［11］，以相應(yīng)的試劑空白作參比，靜置1 min 后立刻倒入l cm 石英比色皿中，在波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定其吸光度，觀(guān)察45 min，前10 min 每2 min記錄1 次，之后每5 min 記錄1 次，見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，不加任何有機(jī)試劑時(shí)，BaSO4膠體吸光度值在8 min 內(nèi)較穩(wěn)定，8 min 后除濃度為4 μg/mL 外其它各個(gè)濃度的吸光度值均逐漸下降，濃度越大，吸光度下降越快，是由于BaSO4膠體顆粒沉降造成的。在未添加膠體保護(hù)劑的條件下，BaSO4膠體的穩(wěn)定性較弱，因此需要加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑。

圖3 不加保護(hù)劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.3 The stability test without stabilizer

2.3.2 加入不同有機(jī)試劑作保護(hù)劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

膠體穩(wěn)定劑能控制生成BaSO4晶粒的大小，增加膠粒的親水性，同時(shí)增加介質(zhì)的粘度，以利于分散相的穩(wěn)定防止BaSO4膠體顆粒的沉淀，使其在體系中分散均勻、穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，使測(cè)得的吸光度穩(wěn)定可靠［9］。取4 mL 硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入甘油、丙酮、無(wú)水乙醇、吐溫80、甘油-乙醇(1 ∶1)各2 mL，按實(shí)驗(yàn)方法，以相應(yīng)的試劑空白作參比，測(cè)定吸光度，觀(guān)察45 min，前5 min 每1 min 記錄1 次，之后每5 min 記錄1 次，見(jiàn)圖4。

圖4 保護(hù)劑的選擇Fig.4 The test of choice stabilizer

由圖4 可知，加入丙酮等有機(jī)試劑后，膠體吸光度值穩(wěn)定時(shí)間至少達(dá)45 min。但不同的保護(hù)劑有不同的效果:加丙酮、甘油、無(wú)水乙醇、吐溫80、甘油-乙醇(1 ∶1)穩(wěn)定劑均較穩(wěn)定，但是加甘油-乙醇(1 ∶1)的吸光度值最大且穩(wěn)定性較好，所以選擇甘油-乙醇(1 ∶1)作保護(hù)劑。

進(jìn)一步對(duì)膠體保護(hù)劑的用量進(jìn)行考察。取硫標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度16 μg/mL 時(shí)，分別加入0.5，1.0，2.0，3.00，4.00，5.00 mL 保護(hù)劑，按照實(shí)驗(yàn)方法，以相應(yīng)的試劑空白作參比，測(cè)定吸光度，見(jiàn)圖5。添加保護(hù)劑的用量要在適宜的范圍內(nèi)體系才較為穩(wěn)定，保護(hù)劑含量過(guò)低使體系穩(wěn)定性降低，保護(hù)劑含量過(guò)高使體系不易澄清影響比色。

圖5 保護(hù)劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.5 The influence on the absorbance of different amount of stabilizer

由圖5 可知，在加入保護(hù)劑2 mL 時(shí)體系有最大的吸光度值，因此確定保護(hù)劑用量為2 mL。

進(jìn)一步對(duì)加入膠體保護(hù)劑后不同SO2－4濃度的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。以甘油-乙醇(1 ∶1)作為膠體保護(hù)劑，在不同SO2－4濃度時(shí)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)方法，以相應(yīng)的試劑空白作參比，測(cè)定吸光度，觀(guān)察45 min，前5 min 每1 min 記錄1 次，之后每2 min 記錄1 次，到10 min 后每5 min 記錄1 次，見(jiàn)圖6。

圖6 加保護(hù)劑后不同SO2－4 濃度的穩(wěn)定性Fig.6 The stability test of stabilizer

由圖6 可知，在體系中加入2 mL 甘油-乙醇(1 ∶1)作為膠體保護(hù)劑，在不同SO2－4濃度下體系的穩(wěn)定性較好。

2.4 BaCl2 形態(tài)及劑量影響

目前普遍使用的方法是將BaCl2·H2O 晶體研細(xì)，過(guò)篩0.25 ～0.5 mm 后使用，本實(shí)驗(yàn)選用此方法和配制成10%BaCl2溶液作為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，加入10% BaCl2溶液作為實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性較好，變異系數(shù)為0.82%。加入BaCl2·H2O 晶體顆粒的穩(wěn)定性較差，變異系數(shù)為7.5%。在沉淀的形成過(guò)程中，加入液體BaCl2則為液-液反應(yīng)，此時(shí)溶液中的微小顆粒相互發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)速度較快。當(dāng)加入一定粒級(jí)范圍內(nèi)均勻的固體BaCl2時(shí)則為固-液反應(yīng)，不利于BaSO4的形成和均勻懸浮，在30 min 內(nèi)吸光度呈持續(xù)上升趨勢(shì)。

圖7 氯化鋇形態(tài)的選擇Fig.7 The test of form of BaCl2

2.5 BaCl2 溶液用量考察

取標(biāo)準(zhǔn)品濃度16 μg/mL 時(shí)，加入2 mL 甘油-乙醇(1 ∶1)保護(hù)劑，用去離子水稀釋到20 mL 左右，分別加入0.5，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 10 mg/mL BaCl2溶液，再加入2 mL 25% HCl 溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，靜置3 min，傾入1 cm玻璃比色皿中，以試劑空白作參比，在波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定其吸光度，見(jiàn)圖8。

圖8 氯化鋇用量的選擇Fig.8 The test of content of BaCl2

由圖8 可知，BaCl2溶液用量在2 ～5 mL 吸光度最大且穩(wěn)定。

當(dāng)溶液中BaSO4的結(jié)晶速度大于溶解速度時(shí)，溶液中BaSO4晶體顆粒數(shù)逐漸增加，吸光度逐漸上升，當(dāng)體系達(dá)到平衡時(shí)吸光度最高。如果繼續(xù)加入BaCl2，體系中Ba2+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其沉淀反應(yīng)所需要的量，導(dǎo)致部分沉淀聚沉并且使沉淀溶解度增大，因此BaCl2加入量需在適量范圍內(nèi)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇BaCl2加入量2 mL 為宜。

2.6 溫度選擇

取標(biāo)準(zhǔn)品濃度16 μg/mL 時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)方法，分別在20，30，40，50，60，70，80，90 ℃下加熱10 min，冷卻，測(cè)量吸光度值，分析溫度對(duì)吸光度的影響。由圖9 可知，加熱溫度20 ～40 ℃吸光度值較穩(wěn)定，加熱溫度超過(guò)50 ℃后吸光度值呈逐漸下降趨勢(shì)。溫度對(duì)硫酸鋇比濁法的吸光度的影響有正反兩方面，一方面，溫度升高可以縮短沉淀的陳化時(shí)間加速轉(zhuǎn)化為晶體大顆粒使吸光度增大;另一方面，溫度升高使沉淀的溶解度增大吸光度下降。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定性好，選擇在室溫下進(jìn)行。

圖9 溫度的選擇Fig.9 The test of choose different temperature

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.369 7 g 烘至恒重的Na2SO4，去離子水定容至250 mL 容量瓶中，得含量為1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液，取10 mL 到100 mL 容量瓶中去離子水定容，即稀釋了10 倍，得0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在9 個(gè)25 mL 容量瓶中，分別加入0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 mL 硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為:0.00，4，8，12，16，20，24，28，32 μg/mL，按照選定的樣品測(cè)定方法測(cè)定吸光度，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及相應(yīng)的吸光度繪制工作曲線(xiàn)(圖10)，其線(xiàn)性回歸方程為:y =0.006 3x－0.000 2，R2=0.998 4。

圖10 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.10 The results of sulfur standard curve

2.8 樣品量的考察

精密吸取處理好的葡萄樣品供試品溶液，分別加入1，2，3，4，5 mL，用選定的方法，測(cè)定吸光度，選定樣品的量，見(jiàn)圖11。

由圖11 可知，加入樣品2 mL 后吸光度值為0.111，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的12 ～20 μg/mL，較合適。

圖11 樣品量的考察Fig.11 The test of sample amount

2.9 重復(fù)性和加樣回收率

取同一份樣品供試品溶液，用選定的方法，樣品平行處理6 次，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度值A(chǔ) 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD 為1.32%，表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

精密稱(chēng)取6 份樣品各1 g，分成3 組，各組分別加入對(duì)照品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1，平均回收率為99.17%，RSD 為1.89%，符合方法要求的回收率，表明該測(cè)定方法可用于植物葉片中硫含量的測(cè)定。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of recovery experiment

3 結(jié)論

在植物中的硫有兩種存在形式:有機(jī)硫和無(wú)機(jī)硫，大部分的有機(jī)硫以蛋白質(zhì)形式出現(xiàn)，形態(tài)和含量比較穩(wěn)定;無(wú)機(jī)硫多以SO2－4的形式在細(xì)胞中，含量隨著硫素供應(yīng)水平的變化存在很大的差異。植物從土壤中吸收硫素主要是以SO2－4的形式逆濃度梯度的主動(dòng)吸收過(guò)程進(jìn)入植物體內(nèi)，然后通過(guò)代謝合成為有機(jī)硫固定在細(xì)胞中，也可以轉(zhuǎn)移到其他部位被再次利用［1］。同時(shí)，植物可以吸收大氣中的硫化氫、二氧化硫等供生長(zhǎng)發(fā)育的需要。植株中SO2－4可作為硫素診斷的指標(biāo)［12］。

由于不同研究文獻(xiàn)中硫酸鋇比濁法的比色條件有一定的差異，對(duì)于不同的樣品材料會(huì)產(chǎn)生比較大的誤差［8］。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)硫酸鋇比濁法對(duì)測(cè)定植物葉片硫含量進(jìn)行系統(tǒng)的研究，在硫濃度為0 ～32 μg/mL 內(nèi)與其吸光值有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.998 4);檢測(cè)波長(zhǎng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定為470 nm，葡萄葉片提取液2 mL 在甘油-乙醇(1 ∶1)2 mL，10 mg/mL BaCl2溶液2 mL，25% HCl 溶液2 mL，常溫下反應(yīng)的條件下，測(cè)定其470 nm 處的吸光值，平均回收率為99.17%，RSD 為1.89%。該法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、準(zhǔn)確性高、精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)植物葉片中硫含量可靠方法。

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