曹金秀，王永生

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

鈾是重要的國防和能源物質(zhì)，它的日益增長(zhǎng)的開發(fā)和利用給人類帶來了福音;同時(shí)，也增加了人們暴露這種有毒有害物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。所以，對(duì)環(huán)境中鈾污染物進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)是極其重要的?，F(xiàn)行檢測(cè)鈾酰離子的技術(shù)有電化學(xué)分析法［3］、光譜分析法［4］、質(zhì)譜分析法［5］和放射線檢測(cè)法［6］等。雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但考慮到環(huán)境樣品組分復(fù)雜、含量低以及昂貴儀器不宜推廣等因素，本文建立了一種簡(jiǎn)便、高特異性和高靈敏度的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

酶 鏈:5 ’-TCTCTTCAGTTCGGAAACGAACCTTCAGACATAGTGAGTC-3’、底物鏈:5’-CCCCAGTCACTCACTATrAGGAAGAGAT-3’、UO2(CH3CO2)2·2H2O 、MES、SYBR GreenⅠ、焦炭酸二乙酯均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所有試劑和水均用1‰焦炭酸二乙酯處理。

F-4500 熒光分光光度計(jì);AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計(jì)。

1.2 溶液制備

1.2.1 鈾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取UO2(CH3CO2)2·2H2O 標(biāo)準(zhǔn)品0.021 4 g，滅菌超純水溶解并定容至50.0 mL 容量瓶中，即得鈾儲(chǔ)備溶液濃度為10－3mol/L。

1.2.2 鈾標(biāo)準(zhǔn)工作液 臨用前用滅菌超純水將鈾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至10－7mol/L。

1.2.3 MES 緩沖溶液(pH 5.5，500 mmol/L) 準(zhǔn)確稱取11.560 0 g MES，定容至100 mL 容量瓶，調(diào)節(jié)pH 為5.5 存儲(chǔ)備用。

1.2.4 SYBR Green Ⅰ(5 ×) 用10 000 ×SYBR Green Ⅰ逐級(jí)稀釋得到，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在2 mL 的EP 管中，依次加入7 μL(5 μmol/L)底物鏈，5 μL(5 μmol/L)酶鏈，10 μL MES 緩沖溶液(pH 5.5)，于95 ℃水浴5 min，室溫放置1 h。在制備的核酸酶(DNAzyme)中加入不同體積的鈾標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫反應(yīng)40 min，然后加入50 μL SG 溶液(5 ×)，混勻并加水補(bǔ)齊至450 μL，室溫孵育15 min后，置于石英比色皿，于熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描。光譜測(cè)定條件:狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為524 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特性

圖1 DNAzyme-SG-UO22+體系的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of DNAzyme-SG-UO22+ system c UO22+(×10 －8 mol/L)/(1 ～6):0，0.5，1.1，2.7，3.3，4.4

由圖1 可知，DNAzyme-SG 復(fù)合物的熒光強(qiáng)度很強(qiáng)(曲線1)，當(dāng)加入不同濃度的之后，體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱(曲線2 ～6)，且濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。據(jù)此，建立了非標(biāo)記熒光法檢測(cè)的新方法。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 MES 緩沖液的pH 值及用量?jī)?yōu)化 用MES緩沖溶液，研究了pH 4.0 ～6.5 范圍內(nèi)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖2。

圖2 pH 對(duì)體系熒光的影響Fig.2 Effect of pH on the fluorescence

由圖2 可知，pH 由4.0 ～5.5 時(shí)，體系的熒光變化值逐漸增加，當(dāng)pH 為5.5 時(shí)，體系的熒光變化值最大。隨后，pH 繼續(xù)增加，熒光變化值反而減小，這可能是鈾酰離子與其特異性的DNAzyme 作用對(duì)pH有嚴(yán)格要求。進(jìn)一步進(jìn)行用量?jī)?yōu)化，實(shí)驗(yàn)表明，加入10 μL MES 能得到較好的ΔF。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10 μL、pH 5.5 的MES 緩沖溶液控制溶液酸度。

2.2.2 SG 用量?jī)?yōu)化 本體系的檢測(cè)信號(hào)是由SG染料提供，進(jìn)行用量?jī)?yōu)化時(shí)在5 ～150 μL 范圍內(nèi)。隨著SG 用量增加，F(xiàn) 值增加，在加入量為50 μL 時(shí)開始出現(xiàn)平臺(tái)，說明體系核酸鏈嵌入染料已經(jīng)飽和，因此，本實(shí)驗(yàn)選用50 μL SG。

圖3 SG 用量對(duì)體系熒光的影響Fig.3 Effect of SG on the fluorescence

2.2.3 鈾酰離子作用時(shí)間優(yōu)化 體系的ΔF 隨著鈾酰離子作用時(shí)間增加而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到40 min 時(shí)出現(xiàn)平臺(tái)期，故實(shí)驗(yàn)選有40 min 為作用時(shí)間。

2.2.4 核酸鏈比例優(yōu)化 為了保證核酸鏈充分形成雙鏈，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)成本的考慮，對(duì)底物鏈和酶鏈比例進(jìn)行了優(yōu)化，底物鏈與酶鏈的摩爾比達(dá)到7∶5，體系得到較好的ΔF。

2.3 測(cè)定方法的選擇性

在優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)了可能共存的多種離子和物質(zhì)對(duì)體系的影響，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤± 5% 時(shí)，500 倍Ca2+;200 倍Mg2+;100 倍 的H2PO4－、PO43－、K+、HPO42－、Cu2+、Sr2+、Zn2+、Al3+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Cr3+、Tb3+、Cl－、CO22－、SO42－、Hg2+;50 倍Pb2+均不干擾測(cè)定，說明該方法選擇性良好。

2.4 測(cè)定方法的檢測(cè)范圍、檢出限和精密度

在優(yōu)化出的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，鈾酰離子濃度范圍為1.73 ×10－9～4.40 ×10－8mol/L 時(shí)，體系的熒光變化值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔF=108.99C(×10－8mol/L)+79.22，相關(guān)系數(shù)r =0.990。根據(jù)空白管的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k 算出LOD 為5.2 ×10－10mol/L。平行測(cè)定11次濃 度 為1.11 × 10－8，2.22 × 10－8，3.33 ×10－8mol/L的鈾酰離子，RSD 依次為2.16%，1.50%和3.10%。

2.5 樣品測(cè)定

采集一份鈾礦石浸潤液和一份鈾礦山地表徑流水，將水樣混勻后濾紙過濾，然后再用0.22 μm 針頭式過濾器二次過濾除去雜質(zhì)。隨后用pH =5.5 MES 緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的pH，加入量為每5 mL 水樣中加入0.5 mL MES 緩沖溶液。樣品中鈾酰離子濃度較大，分別稀釋2 000 倍和1 000 倍，儲(chǔ)存?zhèn)溆?將2 個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品中UO22+檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 1 Determination results of UO22+ in the samples

3 結(jié)論

鈾酰離子特異性識(shí)別鈾脫氧核酶，使之在rA 堿基處斷裂，釋放出單鏈，導(dǎo)致SG 從雙鏈DNA 中游離出來，熒光信號(hào)發(fā)生改變，據(jù)此建立了環(huán)境水樣中痕量鈾的檢測(cè)新方法。新建方法簡(jiǎn)便、實(shí)用、靈敏度和選擇性高，已用于實(shí)際樣品中的測(cè)定，結(jié)果滿意。

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