張洋,郝海葉,那冬晨
(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西臨汾041004)
景天屬(Sedum)植物多為一年生或多年生草本,大多為肉質(zhì)植物,莖葉多汁液,耐旱性極強(qiáng),花朵美麗,花色豐富。植株矮小,株高20~50 cm。景天屬在我國共有124種,1亞種,14變種以及1變型,大多數(shù)產(chǎn)于熱帶干旱地區(qū),主要野生于巖石地帶、山坡石縫、林下石質(zhì)坡地、山谷石崖等處。喜光照,適生溫度為15~18℃,部分種耐陰,對土質(zhì)要求不嚴(yán)[1]。喜濕潤,但忌澇[2],性耐寒,宜于砂壤土生長。
DNA條形碼(DNAbarcoding)是利用DNA片段快速鑒別物種的基因工具,可通過比對一段較短的DNA序列進(jìn)行物種鑒定。在理論上,這段短序列可以區(qū)分并鑒定地球上所有物種。構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫,利用該項(xiàng)技術(shù)鑒別己知物種和發(fā)現(xiàn)新物種,是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最新方向[3]。筆者以部分景天屬植物為材料,尋找該屬植物DNA條形碼的適宜引物,為確定該屬植物的DNA條形碼序列、快捷有效地鑒別該屬植物奠定基礎(chǔ),同時也可促進(jìn)該屬植物親緣學(xué)和化學(xué)分類學(xué)等的研究。
1.1 試驗(yàn)材料 佛甲草、八寶景天、華北景天、費(fèi)菜、垂盆草。
1.2.1 DNA提取。分別采摘上述5種植物生長良好的嫩葉,進(jìn)行葉綠體DNA和核DNA的分步提?。?-6]。所得DNA于-20℃冰箱保存。
1.2.2 引物篩選。參考相關(guān)的DNA條形碼通用序列研究資料,結(jié)合景天屬植物的形態(tài)特征和生理特征,初步選取psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS2、matK 作為候選序列(表1)。
表1 候選引物序列
對上述6對候選序列引物進(jìn)行篩選,并進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。各對引物相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系見表2,反應(yīng)條件見表3。其中matK序列需要進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增,第2次擴(kuò)增以第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,用同樣的反應(yīng)條件進(jìn)行第2次擴(kuò)增。
表2 PCR反應(yīng)體系 μl
表3 PCR反應(yīng)條件
1.2.3 電泳檢測。提取的核DNA和葉綠體DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.1.1 psbA-trnH、ropB、rpoC1。研究表明,psbA-trnH、ropB、rpoC1 3對引物均可作為景天屬植物的DNA條形碼引物。3對引物的擴(kuò)增率都達(dá)到100%,擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為250~450 bp、500 bp 左右、500 ~650 bp,且種間差異明顯,種內(nèi)差異較小(圖1~3)。
2.1.2 rbcL、matK。研究表明,rbcL、matK 2 對引物不適合作為景天屬植物DNA條形碼的引物。其中rbcL序列的擴(kuò)增率僅為40%,擴(kuò)增出來的片段大小在750 bp左右。matK序列經(jīng)過2次擴(kuò)增未能檢測到相關(guān)產(chǎn)物。
2.2 核DNA序列引物的篩選 ITS2序列PCR擴(kuò)增率也達(dá)到100%,擴(kuò)增片段大小為700~750 bp(圖4)。
(1)該試驗(yàn)最終在 psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6對引物中成功篩選出3對葉綠體DNA引物對(psbA-trnH、ropB、rpoC1)和1對總DNA引物對(ITS 2)。這4對引物可以進(jìn)行相互組合,從而能更好地對景天屬植物進(jìn)行分類。
(2)據(jù)文獻(xiàn)記載,ITS2序列大小一般在400~500 bp,而該試驗(yàn)經(jīng)過多次重復(fù),結(jié)果顯示ITS 2序列大小為700~750 bp;另有文獻(xiàn)顯示一些景天科植物中rbcL的擴(kuò)增率達(dá)100%,該試驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù),擴(kuò)增率均不超過40%。以上差異之處還有待于進(jìn)一步深入研究。
[1]那冬晨,任彩琴,柴婷婷,等.華北景天葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對水分脅迫的響應(yīng)[J].北方園藝,2011(17):96 -98.
[2]那冬晨,王文斗,楊麗靜,等.水分脅迫對華北景天葉片結(jié)構(gòu)和葉綠素含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(26):15902 -15903,15912.
[3]王歡歡,郭春景,張興,等.輻射八寶景天ISSR遺傳多樣性分析[J].北方園藝,2010(9):149-151.
[4]李春霞,李宏飛.CTAB法高效提取蘋果葉片DNA的研究[J].北方園藝,2009(2):49-52.
[5]郝海葉,張洋,那冬晨.景天屬植物葉綠體DNA與核DNA分步提取方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(25):10230 -10231.
[6]王文斗,段英俊,那冬晨.植物總 DNA提取方法的改進(jìn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(24):9913,9923.