李薇莎， 姚 春， 耿秀英， 高 燕， 姜 艷， 李澤生

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,云南瑞麗 678600)

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野生鼓槌石斛的有性擴(kuò)繁方法

李薇莎， 姚 春， 耿秀英， 高 燕， 姜 艷， 李澤生*

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,云南瑞麗 678600)

[目的]采集野生鼓槌石斛的成熟蒴果，利用組培無(wú)菌快繁技術(shù)獲得大量野生鼓槌石斛種苗。[方法]將野生鼓槌石斛成熟蒴果消毒滅菌，并將其種子播種于MS培養(yǎng)基上獲得大量原球莖，然后分別轉(zhuǎn)接到不同的培養(yǎng)基上，最后在不同階段的培養(yǎng)基上篩選出適合野生鼓槌石斛分化和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。[結(jié)果]將野生鼓槌種子在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，種子萌發(fā)率達(dá)95%以上；最利于原球莖分化的培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+土豆泥4%+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，成苗率高、出苗整齊；最適幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+香蕉汁7%+土豆泥2%+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，小苗粗壯、葉片濃綠；最適生根壯苗培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+香蕉汁7%+土豆泥2%+AC 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，瓶苗生根多而粗壯，葉片濃綠生長(zhǎng)整齊。[結(jié)論]該研究為野生鼓槌石斛資源的收集與保存提供了參考。

野生鼓槌石斛；種子；有性擴(kuò)繁

鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl.)，又名金弓石斛、芭蕉果石斛、粗黃草等，為蘭科多年生附生草本植物，生于海拔520～1 620 m的陽(yáng)光充足的常綠闊葉林中樹(shù)干上或疏林下巖石上。產(chǎn)于我國(guó)云南西南部及緬甸、馬來(lái)西亞、印度等國(guó)家[1-3]。它是一種重要的觀賞植物，也是我國(guó)民間習(xí)用藥用石斛種類(lèi)之一，其花、莖均可入藥[4-5]。由于人們過(guò)度采集，加上自然條件下種子的萌發(fā)率極低，目前野生石斛已瀕臨滅絕[6-7]。因此，在挖掘自然資源的同時(shí)，結(jié)合我國(guó)邊疆少數(shù)民族地區(qū)脫貧致富、結(jié)合退耕還林、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)村種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整等項(xiàng)目，對(duì)野生鼓槌石斛種源進(jìn)行收集、評(píng)價(jià)和研究，篩選優(yōu)良品種，積極開(kāi)展人工規(guī)范化種植，既是解決鼓槌石斛市場(chǎng)供求矛盾的有效措施，也是提高農(nóng)民收入的新途徑，這樣既可以增加藥源，又能保護(hù)和持續(xù)利用自然資源。筆者在此對(duì)野生鼓槌石斛進(jìn)行有性擴(kuò)繁試驗(yàn)研究，為野生鼓槌石斛的資源保存利用及種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 野生鼓槌石斛成熟蒴果作為外植體進(jìn)行無(wú)菌播種并培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 材料消毒。摘取成熟蒴果后，先用洗衣粉液浸泡刷洗果子表面，然后用流水沖洗10～15 min，接著用無(wú)菌水沖洗3遍，用75%的酒精消毒1 min，再用0.02%的升汞浸泡10 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～6次并用無(wú)菌濾紙吸干果表水分放置備用。

1.2.2 播種及培養(yǎng)條件。將消毒滅菌后的野生鼓槌石斛蒴果在超凈工作臺(tái)上切開(kāi)，將種子均勻地播灑在滅菌后的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)的各個(gè)階段均將處于培養(yǎng)溫度(25±2)℃、每日光照10～12 h、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx條件下培養(yǎng)。

1.2.3 培養(yǎng)基配方。

1.2.3.1 種子萌發(fā)無(wú)菌培養(yǎng)。將消毒完成的野生鼓槌石斛種子均勻地播種到MS培養(yǎng)基上，觀察種子萌發(fā)情況。

1.2.3.2 原球莖分化培養(yǎng)。將萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)到以3/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同激素配比的培養(yǎng)基上，分別以0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L NAA，0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L 6-BA各4個(gè)濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)，附加相同濃度的土豆泥4%，每組20個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)接一星期左右，有的原球莖開(kāi)始分化出一片幼葉，繼而發(fā)育成小苗，通過(guò)70 d左右的培養(yǎng)，觀察16組不同培養(yǎng)基對(duì)原球莖發(fā)育情況。

1.2.3.3 小苗生長(zhǎng)培養(yǎng)。原球莖分化成小苗后，分別轉(zhuǎn)到以3/4MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素配比為NAA 0.8 mg/L、6-BA 0.2 mg/L，添加附加物分別以香蕉汁5%、7%、10%，土豆泥2%、4%、6%各3個(gè)濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)培養(yǎng)瓶接20株小苗，每組20個(gè)重復(fù)，經(jīng)過(guò)70 d的培養(yǎng)，觀察不同添加物對(duì)野生鼓槌石斛幼苗生長(zhǎng)的影響，篩選出最適合鼓槌石斛幼苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

1.2.3.4 生根壯苗培養(yǎng)基。將培養(yǎng)70 d后生長(zhǎng)良好整齊的小苗分別轉(zhuǎn)到不同濃度碳粉的培養(yǎng)基上(表1)，每瓶接20株小苗，每組20瓶，觀察生長(zhǎng)情況。

表1 生根壯苗培養(yǎng)基

2 結(jié)果與分析

2.1 野生鼓槌石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)及成苗過(guò)程 取成熟的種胚接種于MS培養(yǎng)基上，前7 d遮光培養(yǎng)使種子萌發(fā)，后期在1 500～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)，14 d后，種胚開(kāi)始膨大，突破種皮形成裸露的種胚或原球莖體，20～40 d顏色漸漸從淡綠色慢慢變成深綠色，45 d就可分化出原球莖及幼葉等綠色組織，種子萌發(fā)率達(dá)95%以上，此時(shí)可以將其轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基。由于在原培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基養(yǎng)分減少，產(chǎn)生有害物質(zhì)，原球莖會(huì)慢慢變黃直至完全死亡，對(duì)后期的苗生長(zhǎng)具有一定影響，因此需要及時(shí)將小苗轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，才能獲得健壯的小苗。2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)野生鼓槌石斛原球莖分化成苗的影響 由表2可知，雖然每種激素配比培養(yǎng)基均有分化出幼苗，但成苗率及幼苗生長(zhǎng)情況相差較大，其中以7號(hào)培養(yǎng)基上幼苗分化生長(zhǎng)情況最好，出苗均勻整齊，幼苗粗壯，以1號(hào)、13號(hào)培養(yǎng)基最差，出苗率極低，幼苗長(zhǎng)勢(shì)差。試驗(yàn)結(jié)果表明，最利于鼓槌石斛小苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+土豆泥4%+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L。2.3 不同添加物對(duì)野生鼓槌石斛小苗生長(zhǎng)的影響 由表3可知，不同添加物的培養(yǎng)基對(duì)幼苗的莖葉發(fā)育影響較大，隨著土豆泥含量的增加，葉片發(fā)黃的概率越大，但對(duì)根系發(fā)育沒(méi)太大影響，其中以b培養(yǎng)基上幼苗生長(zhǎng)情況最好，不僅小苗生長(zhǎng)整齊粗壯，根系發(fā)達(dá)，且?guī)缀跻膊怀霈F(xiàn)其他幾種培養(yǎng)基中的部分葉片變黃的現(xiàn)象，以g培養(yǎng)基上幼苗生長(zhǎng)最差，小苗較嫩且葉片發(fā)黃率高達(dá)60%。試驗(yàn)結(jié)果表明，最利于鼓槌石斛幼苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+香蕉汁7%+土豆泥2%+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L。

表2 不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)野生鼓槌石斛原球莖分化成苗的影響

表3 不同添加物配比的培養(yǎng)基對(duì)野生鼓槌石斛幼苗生長(zhǎng)的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)野生鼓槌石斛生根壯苗的影響 由表4可知，不同成分培養(yǎng)基顯著地影響野生鼓槌石斛苗的生長(zhǎng)發(fā)育，其中以III號(hào)培養(yǎng)基上苗長(zhǎng)勢(shì)最好，瓶苗生根多而粗壯，葉片濃綠，植株整體性狀良好，小苗分化株數(shù)最多(圖1)，以I號(hào)培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最差，植株平均長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，有部分小苗葉片有發(fā)黃現(xiàn)象，培養(yǎng)基上出現(xiàn)零星褐色雜質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合野生鼓槌石斛生根壯苗的培養(yǎng)基為3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+香蕉7%+土豆泥2%+AC 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L。

表4 不同成分培養(yǎng)基對(duì)野生鼓槌石斛生根壯苗的影響

注：株高、莖粗、葉片數(shù)、根數(shù)及每瓶苗數(shù)均是每種處理的平均數(shù)。

3 結(jié)論與討論

(1)從試驗(yàn)結(jié)果分析，野生鼓槌石斛種子無(wú)菌播種比較簡(jiǎn)單，種子易萌發(fā)，且萌發(fā)率高。萌發(fā)后原球莖轉(zhuǎn)接到下一代培養(yǎng)瓶中要相對(duì)均勻密集地平鋪于培養(yǎng)基表面，分化出小苗才比較快，生長(zhǎng)較均勻。

(2)野生鼓槌石斛在分化階段以添加NAA 0.8 mg/L、6-BA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上幼苗分化情況最好，出苗均勻整齊，成苗率高；在生長(zhǎng)階段以添加香蕉汁7%、土豆泥2%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，不僅小苗生長(zhǎng)整齊粗壯，葉片濃綠，根系發(fā)達(dá)，且?guī)缀跻膊怀霈F(xiàn)其他幾種培養(yǎng)基中的部分葉片變黃的現(xiàn)象。在幼苗分化生長(zhǎng)過(guò)程中植株分化出新芽數(shù)少，且葉片容易變黃，通過(guò)調(diào)整不同添加物的濃度黃化現(xiàn)象得到改善且分

化小芽數(shù)量增加。分化出新芽的數(shù)量不多可能與野生鼓槌石斛的生長(zhǎng)特性有關(guān)，自然條件下野生鼓槌石斛的抽芽率不高且生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。

(3)在生根壯苗培養(yǎng)階段添加0.5 g/L的活性碳粉可以消除培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象，且分化出的根多而粗壯。培養(yǎng)基褐化可能是由于小苗在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌出褐色有色物質(zhì)且影響小苗的生長(zhǎng)發(fā)育，因?yàn)榛钚蕴坑形阶饔茫约尤胩挤垡院蠛肿兿Р⒋龠M(jìn)了根部的發(fā)育，使苗生長(zhǎng)發(fā)育得更好。

[1] 王雁，李振堅(jiān)，彭紅明.石斛蘭：資源·生產(chǎn)·應(yīng)用[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2007：32-33.

[2] 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志(第14卷)[M].北京:科學(xué)出版社，2003.

[3] 云南省藥物研究所.云南天然藥物圖鑒[M].昆明：云南科技出版社，2002：476.

[4] 唐德英.野生鼓槌石斛引種和栽培技術(shù)[J].中國(guó)中藥雜志，2006(15)： 1297-1298.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:85，265.

[6] 藍(lán)玉甜.鼓槌石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)與小苗組培快繁技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(9)：5380-5382.

[7] 白音，包英華，金家興，等.我國(guó)藥用石斛資源調(diào)查研究[J].中草藥，1996，27(2)：41-43.

The Sexual Propagation Method of WildDendrobiumchrysotoxum

LI Wei-sha,YAO Chun,GENG Xiu-ying,LI Ze-sheng*et al

(Dehong Institute of Tropical Agriculture, Ruili,Yunnan 678600)

[Objective] The research aimed to produce plant seeds via sterile ger mination of the mature capsules of wildDendrobiumchrysotoxumand rapid propagation technique.[Method]First,the mature capsules of wildDendrobiumchrysotoxumwas sterilization and plant seeds on the medium of MS and a large amount of protocorm-like bodies produced from the sterile ger mination,and then transferred to different kinds of medium;last,the optimal media of wildDendrobiumchrysotoxumdifferentiation and growth were screened at different stages.[Result]On the medium of MS,the seeds ger mination rate was up to more than 95%.The optimal medium for the differentiation of wildDendrobiumchrysotoxumprotocorm-like bodies was 3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+mashed potato 4%+sucrose 30 g/L+agar 5 g/L,grown from which the seeding were even and orderly in height;the optimal medium for seedling growth was 3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+banana puree 7%+mashed potato 2%+sucrose 30 g/L+agar 5 g/L,grown from which the plantlets were thick and solid,and leaves were scallion;the optimal medium for rooting was 3/4MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+banana puree 7%+mashed potato 2%+AC 0.5 g/L+sucrose 30 g/L+agar 5 g/L,grown from which the plantlets developed more,robust and orderly roots,and their leaves were scallion.[Conclusion] The study provides the reference for the collection and preservation of the resource of WildDendrobiumchrysotoxum.

WildDendrobiumchrysotoxum;Seeds;Sexual propagation

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部物種資源保護(hù)財(cái)政專(zhuān)項(xiàng)(13RZZY-27)。

李薇莎(1989- )，女，云南隴川人，研究實(shí)習(xí)員，從事熱帶植物研究。*通訊作者，助理研究員，從事熱帶植物研究。

2015-04-21

S 567

A

0517-6611(2015)17-066-02