魯亞靜，陳 庭，李建友，胡章立，昝啟杰，2，陳濤，*

(1．深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2.深圳市野生動物救護(hù)中心，廣東深圳 518040；3.深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，廣東深圳 518004)

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葉子花SSR-PCR體系的優(yōu)化

魯亞靜1，2，3，陳 庭3，李建友3，胡章立1，昝啟杰1，2，陳濤1，3*

(1．深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2.深圳市野生動物救護(hù)中心，廣東深圳 518040；3.深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，廣東深圳 518004)

[目的]優(yōu)化葉子花SSR-PCR體系。[方法] 以喬木葉子花為材料，通過Touchdown PCR擴(kuò)增程序和正交試驗，對影響葉子花SSR-PCR體系的引物濃度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2+濃度和dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優(yōu)條件為引物濃度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+濃度1.5 mmol/L、4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，模板100 ng左右。[結(jié)論]該反應(yīng)體系的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于后續(xù)葉子花遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定等研究。

葉子花；正交試驗；SSR；PCR體系優(yōu)化

葉子花又名三角梅、簕杜鵑、寶巾、九重葛等，為紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(BougainvilleaComm. ex Juss.)植物。葉子花原產(chǎn)南美洲，其栽培品種苞片、花、葉色彩艷麗，已在熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛栽種[1]。葉子花栽培品種有300多個，但名種多達(dá)500個以上。其形態(tài)特征隨各地環(huán)境因子的差異變化很大，經(jīng)典的園藝分類往往難于對栽培品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，RAPD、ISSR、SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)被陸續(xù)用于葉子花的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，為栽培品種的鑒定提供了更準(zhǔn)確可靠的手段[2-5]。

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，是由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR分子標(biāo)記具有雙親共顯性、單一位點高多態(tài)性、試驗結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價和分子鑒定[6-9]。筆者采用Touchdown PCR擴(kuò)增程序和正交試驗設(shè)計[10-11]，對影響葉子花SSR-PCR的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)葉子花SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)和遺傳多樣性分析與種質(zhì)資源鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理 供試喬木葉子花(B.arborea)采自廣東省深圳市仙湖植物園葉子花保育與研發(fā)基地。采集幼嫩葉片用硅膠進(jìn)行干燥處理，取適量樣品用磁珠在Fastprep-24組織破碎儀上打磨。采用經(jīng)典的CTAB法提取總DNA[12]，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：DL500 DNA Maker、PCR擴(kuò)增所用的TaqDNA聚合酶、Mg2+以及dNTPs均購自寶生物工程(大連)有限公司，SSR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

主要儀器：SSR擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD T100TMThermal Cycler上進(jìn)行；DYY-8C型垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，Gene Genius Bio-imaging system凝膠成像儀購于美國。

1.3 葉子花SSR-PCR體系的優(yōu)化

1.3.1 正交試驗設(shè)計。正交試驗所用引物為Bp3，體系驗證引物為Bp1和Bp2，各引物序列見表1。選用L16(44)正交表，對葉子花SSR-PCR條件進(jìn)行引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTPs濃度4因素4水平優(yōu)化試驗(表2)。

表1 不同的葉子花SSR引物

表2 葉子花SSR-PCR體系正交設(shè)計

1.3.2 單因素試驗設(shè)計。利用正交試驗中16組試驗優(yōu)化的結(jié)果，選出一組結(jié)果最佳的濃度組合，以此為基準(zhǔn)進(jìn)行PCR體系單因素試驗。每個因素依照表2進(jìn)行優(yōu)化，從而得到葉子花SSR-PCR最優(yōu)的反應(yīng)體系。

1.3.3 Touchdown PCR擴(kuò)增程序。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)且每個循環(huán)降低0.5 ℃；之后94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，24個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉子花SSR-PCR體系的正交試驗優(yōu)化 以喬木葉子花DNA為模板和所參試的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實現(xiàn)對影響PCR擴(kuò)增的引物濃度、TaqDNA聚合酶量、Mg2+濃度和dNTPs濃度的4水平正交優(yōu)化。2次重復(fù)試驗的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

結(jié)果顯示，所參試的引物能成功擴(kuò)增出預(yù)期長度范圍的目標(biāo)片段。泳道9所擴(kuò)增出的2條帶亮度相差大；泳道13和泳道15所擴(kuò)增出的2條帶清晰可見，穩(wěn)定存在；經(jīng)多次重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)泳道13所擴(kuò)增出的2條帶亮度相當(dāng)，清晰可見，穩(wěn)定存在，而泳道15所擴(kuò)增出的2條帶亮度相差大，會出現(xiàn)1條帶模糊甚至是消失，不能穩(wěn)定存在。因此，正交試驗的第13組為最佳的濃度組合，由表1可知，該組的引物濃度為0.60 μmol/L,TaqDNA聚合酶濃度為1.00 U/20 μl,Mg2+濃度為3.00 μmol/L以及dNTPs濃度為0.20 μmol/L。

2.2 葉子花SSR-PCR體系的單因素試驗優(yōu)化 以正交試驗的第13組濃度組合為基準(zhǔn)，對影響PCR擴(kuò)增的引物濃度、TaqDNA聚合酶量、Mg2+濃度和dNTPs濃度進(jìn)行單因素試驗。圖2為1次試驗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果。

2.2.1 引物濃度。由圖2可知，隨著正反引物濃度的升高，PCR擴(kuò)增條帶的亮度呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)正反引物濃度為0.30 μmol/L時，目標(biāo)條帶不被特異性擴(kuò)增；當(dāng)正反引物濃度為0.40 μmol/L時，擴(kuò)增效果最好；此后，隨著正反引物濃度的升高，形成的二聚體增多，故引物濃度選用0.40 μmol/L。

2.2.2TaqDNA聚合酶量。由圖2可知，隨著TaqDNA聚合酶量的增加，PCR擴(kuò)增條帶的亮度呈上升趨勢。當(dāng)TaqDNA聚合酶量為1.00 U時，目標(biāo)條帶未被特異性擴(kuò)增；當(dāng)TaqDNA聚合酶量為2.00 U時，擴(kuò)增效果最好，之后再增加酶量，擴(kuò)增效果無太明顯的變化。但從節(jié)約試劑和整體的擴(kuò)增效果考慮，TaqDNA聚合酶量為1.50 U時也能達(dá)到預(yù)期的效果，因此，理想的TaqDNA聚合酶量為1.50 U。

2.2.3 Mg2+濃度。Mg2+為TaqDNA聚合酶發(fā)揮活性所必須的，Mg2+濃度過低或過高都會影響PCR擴(kuò)增效率。由圖2可知，隨著Mg2+濃度的增加，PCR擴(kuò)增條帶的亮度呈下降趨勢，故選用1.50 μmol/L Mg2+作為理想的Mg2+濃度。

2.2.4 dNTPs濃度。dNTPs濃度過高時，dNTPs會與Mg2+結(jié)合，降低體系中Mg2+濃度，影響TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTPs濃度過高也會提升錯誤擴(kuò)增幾率，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物和拖尾現(xiàn)象。由圖2可知，隨著dNTPs濃度的升高，PCR擴(kuò)增條帶的亮度呈下降趨勢，故dNTPs濃度選用0.15 μmol/L。

2.3 體系驗證 應(yīng)用上述所得體系，選用不同葉子花(表3)對所設(shè)計的SSR引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶清晰，重復(fù)性好(圖3)。

綜上所述，葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優(yōu)條件：引物濃度0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶用量1.5 U，Mg2+濃度1.5 mmol/L，4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，可用于后續(xù)SSR引物篩選及分析。

表3 用于SSR-PCR反應(yīng)體系驗證的葉子花材料

3 結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)基于特異引物PCR，任何影響PCR擴(kuò)增效果的因子, 如引模板DNA、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度等，都將影響SSR-PCR體系的建立和優(yōu)化。正交試驗設(shè)計優(yōu)化PCR反應(yīng)條件比單因素逐個調(diào)整法的效率更高，試驗設(shè)計更科學(xué)，得出的試驗體系有效范圍寬，穩(wěn)定性好[11]。Touchdown PCR是一種簡單快速的優(yōu)化方法，能夠增加擴(kuò)增反應(yīng)的特異性、敏感性和產(chǎn)物產(chǎn)量，避免了非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)以及對溫度等長時間的優(yōu)化或?qū)σ锏闹匦略O(shè)計[10]。

引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。TaqDNA聚合酶為Mg2+依賴性酶，Mg2+與dNTPs具有拮抗作用，Mg2+濃度過高會降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。朱世楊等[13]在對水稻SSR-PCR體系進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，隨著引物濃度增加，PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的引物二聚體量也呈增加趨勢，尤其是高濃度下產(chǎn)生最多；Mg2+濃度過高反而抑制了Taq酶的活性,導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物降低，該研究也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。模板DNA濃度過低影響擴(kuò)增產(chǎn)量，濃度過高導(dǎo)致擴(kuò)增條帶拖尾甚至無擴(kuò)增條帶，黃芳麗等[14]在對芒果SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)20 μl 體系中模板DNA濃度為60～100 ng時對擴(kuò)增結(jié)果無顯著影響，Yang等[15]在對人參SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，模板DNA濃度為30～120 ng時對擴(kuò)增結(jié)果無顯著影響[15]。因此，該研究將模板DNA濃度控制在100 ng左右，在得到理想結(jié)果的合理范圍內(nèi)。

該研究最終確定葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優(yōu)條件為引物濃度0.4 mmol/L,TaqDNA聚合酶用量1.5 U,Mg2+濃度1.5 mmol/L,4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，模板DNA 100 ng左右，可用于后續(xù)葉子花SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)和遺傳多樣性分析與種質(zhì)資源鑒定研究。

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Optimization of SSR-PCR System forBougainvilleaarborea

LU Ya-jing1，2，3，CHEN Ting3，LI Jian-You3， CHEN Tao1，3*

(1．School of Life Sciences, Shenzhen University，Shenzhen , Guangdong 518060；2. Center for Wildlife Animal Rescure and Protection，Shenzhen, Guangdong 518040；3. Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，Shenzhen, Guangdong 518004)

[Objective] The aim was to optimize SSR-PCR system forBougainvilleaarboreaby orthogonal design.[Method] Based on orthogonal design, four levels of four factors (primer,TaqDNA polymerase, Mg2+, dNTPs) have been tested to optimize SSR-PCR reaction system usingBougainvilleaaboreagenomic DNA as template. The amplification was performed with a touchdown program. [Result]The optimized SSR-PCR reaction condition forBougainvilleaarboreawas obtained in a 20 μl system containing 0.4 mmol/L SSR primer, 1.5 UTaqDNA polymerase, 1.5 mmol/L Mg2+, 0.15 mmol/L dNTPs and around 100 ng DNA template. [Conclusion]With clear, stable and repeatable amplification bands, the reaction system can be used for the further studies on genetic diversity and germplasm identification.

Bougainvilleaarborea; Orthogonal design; SSR; PCR system optimization

深圳市科技研發(fā)資金項目(JCYJ20120615172425764)；深圳市城管局科研項目(200901)。

魯亞靜(1989-)，女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向：資源植物品質(zhì)鑒別與安全應(yīng)用。*通訊作者，研究員，博士，從事資源植物研究與開發(fā)。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-047-03