譚婷婷，王家林，桑 戈，安寶禎

(青島科技大學(xué)生物系，山東青島 266042)

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北方黃酒麥曲中真菌的篩選·鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

譚婷婷，王家林*，桑 戈，安寶禎

(青島科技大學(xué)生物系，山東青島 266042)

[目的]對(duì)北方黃酒麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序以鑒定其中的真菌。[方法]利用梯度稀釋法和劃線純化法共分離純化得到5株霉菌和1株酵母，并對(duì)分離得到的真菌進(jìn)行基因組DNA提取獲得模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到真菌的5.8SrDNA-ITS片段，片段測(cè)序后進(jìn)行Blast比對(duì)鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。[結(jié)果]將5株霉菌鑒定為多枝橫梗霉(Lichtheimiaramosa)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，交鏈孢霉(Alternariamali)，將一株酵母鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。[結(jié)論] 利用分子生物學(xué)的方法對(duì)北方黃酒麥曲樣品中的真菌進(jìn)行了分離、純化和鑒定。

北方黃酒；麥曲；真菌；5.8SrDNA-ITS序列

黃酒具有幾千年的歷史，北方黃酒麥曲是將小麥進(jìn)行過(guò)篩、軋碎、加水拌曲、踏曲、曲房堆曲、保溫培養(yǎng)、通風(fēng)干燥、陳伏后制成[1]，是黃酒的糖化發(fā)酵粗酶制劑。麥曲中的微生物主要有霉菌、細(xì)菌及少量酵母，麥曲中的微生物參與黃酒的釀造過(guò)程，微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)黃酒的風(fēng)味和口感具有十分重要的影響[2]。因此，對(duì)黃酒麥曲中微生物進(jìn)行分類(lèi)鑒定以及特性研究可以為黃酒的釀造提供理論依據(jù)，對(duì)于繼承和保護(hù)北方黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝和口味具有積極的作用。

真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，又叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，由ITS1區(qū)、5.8 S rDNA和ITS2區(qū)組成[3-4]。5.8 S rDNA-ITS序列有極大的保守性，具有顯著的種間差異性，在大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[5]。此外ITS序列片段較小、易于分析。筆者對(duì)北方黃酒麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、測(cè)序以鑒定其中的真菌。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用的麥曲由山東即墨妙府老酒有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基的配制 YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至1 L，115 ℃ 下滅菌30 min。

麥汁培養(yǎng)基：10度麥汁 1 L，瓊脂 20 g，115 ℃下滅菌30 min。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，加入蒸餾水定容至1 L，0.1 MPa下滅菌20 min。

在滅菌后的培養(yǎng)基中添加50 mg/L的鏈霉素，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；加入100 mg/L的去氧膽酸鈉，抑制菌絲蔓延。

1.3 方法

1.3.1 麥曲浸出液的制備。將粉碎好的麥曲20 g加入100 ml 0.9%的無(wú)菌生理鹽水中，加入玻璃珠放入搖床振蕩培養(yǎng)30 min，使麥曲中的微生物均勻地分散于無(wú)菌生理鹽水中，制成麥曲浸出液。

1.3.2 真菌的分離純化。將麥曲浸出液稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，并分別涂布于麥汁培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋倍數(shù)分別平行涂布3個(gè)平板，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取平板中肉眼可見(jiàn)的單菌落進(jìn)行平板劃線，轉(zhuǎn)接劃線直至得到單菌落，之后進(jìn)行鏡檢，確定是單一菌后，用YPD斜面進(jìn)行保種，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 真菌的形態(tài)學(xué)觀察。取分離得到的真菌菌株接種至YPD培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的顏色、形態(tài)等菌落特征。

1.3.4 真菌的分子學(xué)鑒定。利用石英砂法提取真菌DNA。采用通用引物 pITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′)和 pITS4(5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增真菌的 ITS 序列[3]。

25 μl 反應(yīng)體系：18.35 μl ddH2O、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl 4×dNTP、0.15 μlTaq酶，0.5 μl pITS1、0.5 μl pITS4、1 μl模板。 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

使用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體上，連接后轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中[5]，篩選陽(yáng)性克隆送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。登陸NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，將測(cè)得的試驗(yàn)菌株序列在NCBI 的Genbank 中進(jìn)行Blast分析，選取相似性較高的模式菌株的5.8S rDNA-ITS序列，與試驗(yàn)菌株序列一起經(jīng)Clustal X 軟件進(jìn)行匹配后，用Mega 3.1 軟件進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的形態(tài)學(xué)觀察 共從麥曲浸出液中分離出6株霉菌和1株酵母，真菌依次編號(hào)為WSM-1、WSM-2、WSM-3、WSM-4、WSM-5和WTY。其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

注：+ 為陽(yáng)性; - 為陰性。

2.2 真菌的分子鑒定 所測(cè)5.8S rDNA-ITS序列提交GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，對(duì)霉菌進(jìn)行鑒定。同源性分析(表2)顯示這6種霉菌片段大小在571～859 bp。由試驗(yàn)菌株和相關(guān)模式菌株所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)可以看出，25株菌株處于四大分支上。WSM-2與米曲霉(Aspergillusoryzae)和黃曲霉(Aspergillusflavus)聚為一支，且與米曲霉(A.oryzae)相似度為99%；WSM-4與聚多曲霉(Aspergillussydowii)和雜色曲霉(Aspergillusversicolor)聚為一支，且與雜色曲霉(A.versicolor)相似度為100%；WSM-3與朱黃青霉(Penicilliumminioluteum)和產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)聚為一支，且與產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum)相似度為99%；WSM-5與交鏈孢霉(Alternariamali)聚為一支，相似度為100%；WSM-1與多枝橫梗霉(Lichtheimiaramosa)聚為一支，且相似度為99%。故WSM-1、WSM-2、WSM-3、WSM-4、WSM-5分別被鑒定為多枝橫梗霉(L.ramosa)、米曲霉(A.oryzae)、產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、交鏈孢霉(A.mali)。

由酵母和相關(guān)模式菌株所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)可以看出，WTY與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)親緣關(guān)系相近，可將其鑒定為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

表2 麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

3 結(jié)論與討論

該研究對(duì)北方黃酒麥曲樣品中的真菌進(jìn)行了分離純化，共得到5株霉菌和1株酵母，利用分子生物學(xué)方法將5株霉菌鑒定為多枝橫梗霉(L.ramosa)、米曲霉(A.oryzae)、產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、交鏈孢霉(A.mali)。將一株酵母鑒定為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

方華等[6]采用土豆瓊脂培養(yǎng)基、麥汁瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基對(duì)紹興黃酒麥曲中的真菌進(jìn)行了分離、培養(yǎng)和鑒定，共分離出 16 株霉菌，其主要霉菌分別是微小毛霉、傘枝犁頭霉、米曲霉、米根霉和煙曲霉。與該研究相比，北方黃酒麥曲中的霉菌與紹興黃酒麥曲中都有米曲霉的存在，但多枝橫梗霉、產(chǎn)紫青霉、雜色曲霉、交鏈孢霉是北方黃酒麥曲所特有的。

[1] 陳細(xì)丹.黃酒生麥曲的傳統(tǒng)制作工藝[J].釀酒，2011，38(1)：59-60.

[2] 汪建國(guó).傳統(tǒng)麥曲在黃酒釀造中的作用和特色[J].中國(guó)釀造，2004(10)：29-31.

[3] 趙杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004(4)：35-37.

[4] BELLOCH C，BARRIO E，URUBURU F，et al.Characterization of four species of the genus Kluyveromyces by mitochondrial DNA restriction analysis[J].Syst Appl Microbiol，1997，20：397-408.

[5] 鄭雪松，楊虹，李道棠，等.基因間隔序列(ITS)在細(xì)菌分類(lèi)鑒定和種群分析中的應(yīng)用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9(6)：678-684.

[6] 方華，曹鈺，陸健，等.黃酒麥曲中主要霉菌的分子鑒定及分類(lèi)[J].釀酒科技，2006，3(14)：45-47.

Screening, Identification and Phylogenetic Analysis of Fungi in the Wheat Starter from North Yellow Millet Wine

TAN Ting-ting,WANG Jia-lin*,SANG Ge et al

(Department of Biology, Qingdao University of Science & Technology, Qingdao,Shandong 266042)

[Objective] 5.8S rDNA-ITS fragments of fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were amplified and sequenced in order to identify the fungi. [Method] Five strains of moulds and one yeast strain were separated and purified by gradient dilution method and crossed purification. The genomic DNA of fungi cells were extracted as the PCR template, and 5.8SrDNA-ITS fragments of fungi were amplified and sequenced respectively for blasting identify and phylogenetic tree construction. [Result]The moulds were identified asLichtheimiaramosa,Aspergillusoryzae,Penicilliumpurpurogenum,Aspergillusversicolor,Alternariamali,and one yeast strain was identified asSaccharomycescerevisiae. [Conclusion] Fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were separated, purificated and identificated.

North yellow millet wine; Wheat starter; Fungi; 5.8SrDNA-ITS sequence

譚婷婷(1988- )，女，山東昌邑人，碩士研究生，研究方向：釀酒科學(xué)與工程。*通訊作者。

2015-04-15

S 188

A

0517-6611(2015)17-015-02