黃增文，阿曼太，木爾扎提，吾熱力哈孜·哈孜汗*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832003;2.四川省達(dá)川區(qū)畜牧食品局，四川達(dá)州 635000; 3.新疆塔城區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆塔城834700)

黃增文1，2，阿曼太2，木爾扎提1，吾熱力哈孜·哈孜汗1*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832003;2.四川省達(dá)川區(qū)畜牧食品局，四川達(dá)州 635000; 3.新疆塔城區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆塔城834700)

實驗旨在驗證基因真核表達(dá)載體的表達(dá)、純化以及多克隆抗體的制備。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建也木勒白羊基因的真核表達(dá)載體(pEGFP-INH)，并將質(zhì)粒(pEGFP-INH)作為抗原免疫，制備抗INH的多克隆抗體。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了基因的真核表達(dá)載體(pEGFP-INH);該抗體能特異性地與INH的抗原以及卵巢組織產(chǎn)生明顯免疫親和反應(yīng)，說明(pEGFP-INH)能夠有效提高家兔的排卵率。本研究建立了高效穩(wěn)定的INH真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得具有生物學(xué)活性的蛋白，為進一步獲得高特異性的抗體奠定基礎(chǔ)。

基因;真核表達(dá)載體;多克隆抗體;也木勒白羊

卵泡抑制素(inhibin,INH)是睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌的一類糖蛋白激素,由和β 2個亞基通過二硫鍵連接而成的二聚體［1］,其α亞基上有糖基化位點,β亞基有A、B 2種類型,故INH存在2種形式,即INHβA和INHβB［2］。由于抑制素基因疫苗因其制備簡單、構(gòu)建成本低、純度高,因此關(guān)于抑制素基因免疫近年來受到了大家的關(guān)注。抑制素基因免疫是通過注射外源抑制素基因,使其在機體內(nèi)表達(dá),刺激機體產(chǎn)生抗抑制素抗體,中和內(nèi)源性抑制素,促使垂體分泌更多促卵泡素,進而促進卵巢發(fā)育［3］。有大量研究表明,抑制素基因通過不同方式和動物的免疫能夠產(chǎn)生抗抑制素抗體,并對被免疫的動物的排卵和胚胎及胚胎質(zhì)量也有一定影響,如抑制素與GFP融合基因PEGISI免疫大鼠可產(chǎn)生抗抑制素抗體［4］,抑制素基因疫苗PCIS和免疫佐劑共同作用于大鼠可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抗抑制素抗體［5］,抑制素基因疫苗免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)后奶牛產(chǎn)生免疫應(yīng)答［6］,用INH免疫奶牛能進一步提高超排效果,且能增加胚胎數(shù),提高胚胎質(zhì)量［7-8］,抑制素主動免疫山羊,可以有效提高山羊的排卵率［9］并且抑制素基因工程苗可有效提高山羊排卵率［10］。主動和被動免疫抑制素可以提高羊的排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)［11］,以及提高豬和牛的排卵數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)［12］。本實驗以新疆也木勒白羊作為研究對象,克隆其抑制素亞基基因(INH),并構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體,將表達(dá)載體質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000按一定比例混合后注射成年家兔,發(fā)現(xiàn)能夠有效提高試驗兔的排卵率,為研究具有特異性免疫效果抑制素基因疫苗提供了必要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌體、細(xì)胞與載體 pGenesi10-3PVector試劑盒購自武漢金賽生物技術(shù)有限公司;PMD18-T載體購自大連TaKaRa公司,pEGFP-N1載體、大腸桿菌DH5、豚鼠BHK-21細(xì)胞株均為本實驗室保存。

1.2 實驗動物 實驗家兔購自石河子大學(xué)動物實驗中心3月齡,雌性20只,體重3 kg左右。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和小牛血清為GIBCO產(chǎn)品;質(zhì)粒抽提與膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;TurboFectTM inTransfection Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Fermentas公司,Trizol購自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV及內(nèi)切酶等購自大連TaKaRa公司;無內(nèi)毒素大提試劑盒購置于康為公司,生物素化抗體購于晶美生物工程有限公司;鏈霉親合素-辣根過氧化物酶(HRP)購于Biotech生物技術(shù)有限公司,TMB購自Sigma生化有限公司,其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 也木勒白羊卵巢組織的采集 從新疆額敏縣哈拉也木勒鄉(xiāng)牧區(qū)收集純種也木勒白羊 (已正常產(chǎn)2～3胎的健康母羊)卵巢,將卵巢裝入1.5 mL離心管后,放入紗布袋中置液氮速凍,之后置-80℃冰箱備用。

1.5 總RNA的提取與cDNA制備及引物的合成 將收集的卵巢組織于液氮中充分研磨后,按照總RNA提取試劑盒說明書抽提卵巢組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中綿羊INHα全長序列(XM_004004955.1)設(shè)計引物,預(yù)計擴增的產(chǎn)物片段大小約為1 100 bp,上游引物:5′-ATG TGG CTT CAG CTG CTC CTC TTC-3′,下游引物:5-′GAT GCA AGC ACA GTG CTG GGT G-3′,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6 目的基因的獲取及鑒定 用所設(shè)計的引物進行PCR擴增,擴增體系為25 μL,其中2×Mix 12.5 μL、上、下游引物(100 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2 μL、補充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán),循環(huán)參數(shù)94℃變性40 s,68℃退火40 s, 72℃延伸1 min 30 s,35個循環(huán)后,72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,用1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳并觀察。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后與pMDl8-T載體在16℃下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布含50 μg/mL氨芐青霉素LB平板,過夜培養(yǎng),篩選陽性克隆。隨機挑取5個陽性克隆,用PCR法和雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒。將鑒定為陽性的克隆株由上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。

1.7 真核表達(dá)載體(pEGFP-INHα)的構(gòu)建和鑒定 將(pEGFP-INHα)用(Ecol I)和(Sal I)雙酶切后獲得目的基因連接經(jīng)相同酶切的PEGFP-N1載體中,轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌菌株。挑取克隆,經(jīng)PCR鑒定和抽提質(zhì)粒用Sal I和EcoR I雙酶切鑒定,獲得陽性克隆送測序。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒PEGFP-INHα和空載體質(zhì)粒PEGFP-N1純化回收后,分別與轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體2000)按一定比例混勻,在37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中,與BHK細(xì)胞共同孵育。48 h后,在倒置顯微鏡下,檢測載體中綠色熒光表達(dá),收獲細(xì)胞,抽提總RNA,同時破碎細(xì)胞,離心,去上清,進行Western blotting檢測試驗。

1.8 免疫原制備 將OD260/OD280為2.0的真核表達(dá)載體(pEGFP-INHα)質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000按照一定比例配比,最終濃度為1 mg/mL,對照組所用免疫原為等量的生理鹽水。在腿部肌肉分點注射,兩側(cè)各注射0.2 mL。

1.8 免疫原注射方法 每次免疫前24 h于腿部兩側(cè)肌肉各注射鹽酸普魯卡因(0.5%)0.2 mL,在首次注射鹽酸普魯卡因20 h后再次在相同部位注射0.2 mL鹽酸普魯卡因。在注射首次注射普魯卡因24 h后在相同部位注射質(zhì)粒0.2 mL(濃度為1 mg/mL),10 d后用同樣方法再次免疫一次,但第二次免疫劑量減半,共計免疫2次。

1.9 抗體水平測定 利用酶聯(lián)免疫方法(ELISA)測定實驗兔血清中抗體水平。向酶標(biāo)板孔中加入100 μL含15 μg抗原的包被液4℃過。將血樣用5%脫脂奶粉進行1∶12 800稀釋后加100 μL到包被酶標(biāo)板孔中,37℃孵育1 h;清洗后加100 μL稀釋比為l∶l 000的生物素化抗體,37℃孵育1 h;再次清洗后加入100 μL稀釋比為l∶1000的鏈霉親合素-辣根過氧化物酶(HRP),37℃孵育1.0 h。清洗后進行TMB(購自Sigma生化有限公司)顯色,終止反應(yīng)后測定DB450nmB值。

1.10 激素測定 實驗兔血清中FSH水平用放射免疫法測定,測定試劑盒購于北方生物技術(shù)研究所。測定方法在產(chǎn)品說明書的基礎(chǔ)上作適當(dāng)改進,使標(biāo)準(zhǔn)曲線的精度范圍與正常動物激素水平范圍相一致。

1.11 多抗與也木勒白羊卵巢組織的Western blot鑒定 新鮮也木勒白羊卵巢組織經(jīng)液氮研磨后和INHα抗原分別加2×SDS上樣緩沖液,沸水浴5 min, 10 000 r/min離心5 min,上樣順序為1為純化的INHα抗原;2、3為也木勒白羊卵巢組織,12% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST于4℃封閉過夜,TBST洗膜3次 (10 min/次)后,一抗分別為兔多抗血清(1∶1/000)與正常兔血清(1∶1/000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次),按1∶5 000加入二抗,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG;室溫孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次),加ECL顯影。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的分離 所分離總RNA A260/A280為1.9,瓊脂糖凝膠電泳后清晰可見18 S和28 S 2條核糖體RNA條帶(見圖1),卵巢組織總RNA提取過程中未發(fā)生降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 也木勒白羊INHα PCR擴增產(chǎn)物

2.3 重組質(zhì)粒的PCR、酶切和測序鑒定 將回收純化的也木勒白羊抑制素亞基基因和線性化的PEGFP-N1連接轉(zhuǎn)化到DH5,首先用含卡那霉素的培養(yǎng)基進行抗性篩選,經(jīng)PCR和酶切鑒定。如圖3,將確定為陽性的菌株送至上海生工生物工程有限責(zé)任公司測序,測序結(jié)果與克隆基因序列一致,說明本實驗成功構(gòu)建了PEGFP-INH真核表達(dá)質(zhì)粒。

圖3 重組質(zhì)粒PEGFP-INHα酶切鑒定

2.4 血液中抗體滴度 本研究用OD值表示血液中抗體滴度。如表1所示,在初次免疫之前,2組血液的OD值顯示,設(shè)均無抑制素抗體。在初次免疫后第10天及第1次加強免疫后第10天,免疫組血液中抗抑制素抗體水平逐步快速上升。均極顯著高于對照組(＜0.01)。結(jié)果說明在初次免疫抑制素刺激動物機體快速產(chǎn)生抗體,并在2次加強免疫后血液中抗體水平持續(xù)上升,而對照組在整個試驗階段比較分析無抗抑制素抗體產(chǎn)生。

表1 實驗兔血液中抑制素抗體滴度變化(X±SE)

2.5 血漿FSH水平 如表2所示,在初次免疫之前和初次免疫后20 d,2組試驗兔血清中的FSH濃度無顯著差異。雖然免疫組的血清中FSH水平在初次免疫后要比對照組高。第1次免疫后第10天和第2次加強免疫后第10天,免疫組的血清中FSH濃度均顯著高于對照組。說明初次免疫抑制素使試驗兔血清中的FSH水平略有提高。2次加強免疫顯著提高了血漿FSH水平。

表2 免疫抑制素對血清中FSH的影響(X±SE) μg·L-1

2.6 多抗與卵巢組織的Western blot鑒定結(jié)果 如圖4可見,以INH抗原為陽性對照,制備的多克隆抗體不僅可以與表達(dá)純化的INH抗原有反應(yīng)性而且與卵巢組織中天然的蛋白也可以發(fā)生特異性的反應(yīng)。

3 討 論

圖4 多抗血清特異性分析

本研究中用抑制素主動免疫家兔,首次免疫后血液中可以檢測到抑制素抗體,但抗體滴度較低,加強免疫后血液中的抗體逐漸增加,與初次免疫與加強免疫后,各組京白雞卵黃抗體效價逐漸增加［13］與結(jié)果基本一致,但存在個體差異,應(yīng)用也木勒白羊抑制素基因質(zhì)粒作為抗原,目前在國內(nèi)外報道較少。通過本實驗的結(jié)果和數(shù)據(jù)為進一步研究抑制素基因工程疫苗提供了研究依據(jù)。現(xiàn)在利用基因重組技術(shù)獲得有活性的目的蛋白已不再是難事,但是在實際應(yīng)用中對一些特殊的大分子蛋白分子的獲得往往需要分析其具體結(jié)構(gòu)并選擇適宜的載體與菌株才能還原其正確的表達(dá)形式,所以對抑制素亞基的結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)進行分析比較［14］,構(gòu)建了抑制素基因INH重組質(zhì)粒,成功表達(dá)和純化了也木勒白羊抑制素亞基基因并利用重組質(zhì)粒制備了多克隆抗體。通過抑制素基因質(zhì)粒主動免疫后卵巢活性和排卵率增加了,說明用抑制素基因質(zhì)粒主動免疫家兔,可以有效提高家兔的排卵率,這種方法有望成為提高動物綜合繁殖力的新技術(shù)。同時對其特異性進行了鑒定,證明所制備的多抗血清不僅能與INH基因抗原發(fā)生反應(yīng)而且還能與新鮮的卵巢組織發(fā)生特異性反應(yīng)。這為建立更特異的單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Medan M S,Arai K Y,Watanabe G,et al.Inhibin;Regulation of reproductive function and practical use in females［J］.Anim Sci J,2007,78(1):16-27.

［2］ Meldi K M,Gaconnet G A,Mayo K E.DNA Methylation and histone modifications are associated with repression of the inhibin a promoterin the rat corpus luteum［J］.Endocrinology, 2013,153(10):4905.

［3］Li H,Mao D G,Zhang D K,et al.Development and evualuation of a novel DNA vaccine expressing inhibin,a (1-32)fragment for improving the fertility in ratsand sheep［J］.Anim Reprod Sci, 2008,109:251-265.

［4］ 王水蓮,薛立群,刑朝芳,等.卵泡抑制素與GFP融合基因疫苗免疫對大鼠卵巢和生殖激素的影響［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報, 2012,32(2):309-313.

［5］ 茆達(dá)干,楊利國,葉榮,等.抑制素(1～32)基因免疫對大鼠卵泡發(fā)育和生殖激素的影響 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36 (12):1554-1559.

［6］ 王水蓮,馮建忠,李文平,等.非抗性篩選抑制素基因疫苗免疫對奶牛產(chǎn)后子宮復(fù)舊的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,40(4):395-398.

［7］ Li C,Zhu Y L,Xue J H,et al.Immunization against inhibin enhances both embryo quantity and quality in Holstein heifers after superovulation and insemination with sex-sorted semen［J］. Theriogenology,2009,71(6):1011-1017.

［8］ Mei C,Li M Y,Zhong S Q,et al.Enhancing embryo yield in superovulated holstein heifers by immunization against inhibin［J］.Reprod Domest Anim,2009,44(5):735-739.

［9］ 劉桂瓊,姜勛平,丁家桐,等.豬卵泡抑制素主動免疫對山羊生殖的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2003,34(1):37-39.

［10］田允波,黃運茂.主動免疫抑制素對山羊繁殖性能的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(12):122-123.

［11］Kusina N T,Meyer R L,Carlson K M,et al.Passive immunization of ewes against an inhibin like peptide increases follicle stimulating hormone concentrations,ovulation rate,and proliflcacy in spring-mated ewes［J］.J Anim Sci,1995,73(5):1433-1439.

［12］Wheaton J E,Meyer R L,Jones R H,et al.Effectsofpas.sive immunization using antibody against an alpha-inhibin peptide on follicle—stimulating hormone concentrations and litter size in sows［J］.Theriogenology,1998,49(4):813-822.

［13］張紅琳,周紅霞,周業(yè)飛,等.抑制素質(zhì)粒(pCISI)DNA卵黃抗體的制備［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,26(4):891-893.

［14］閆琳,陳鳳儀,田萍,等.降鈣素原對新生兒敗血癥早期診斷的意義［J］.中國實用兒科雜志,2003,18(12):763-764.

S827.2

A文獻標(biāo)識碼:0258-7033(2015)11-0074-04

2014-12-16;

2015-03-05

石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(gxjs2011-yz09)作者簡介:黃增文(1984-),男,重慶榮昌人,碩士研究生,E-mail:xndaxue@126.com

*通訊作者:吾熱力哈孜·哈孜汗 (1965-),男,新疆烏蘇人,博士,副教授,研究方向為動物生殖生理與繁殖技術(shù),E-mail: 1508217366@qq.com