賀 明，王 軍，楊雨江，劉子維，劉 勛，呂文發(fā)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118)

Kisspeptin在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)和功能研究

賀 明，王 軍，楊雨江，劉子維，劉 勛，呂文發(fā)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118)

Kisspeptin(Kp)是KiSS-1基因編碼的產(chǎn)物，為明確Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)和功能，本文首先利用免疫熒光技術(shù)研究了Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟0、6、12、18、24 h的表達(dá)規(guī)律，隨后利用體外培養(yǎng)技術(shù)研究了添加Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明:Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟0、6、12、18、24 h均有表達(dá)，且0～12 h表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)，12～24 h下降并達(dá)到最低;在TCM-199溶液中添加10 nmol/L的Kp可使卵母細(xì)胞的成熟率達(dá)到80.3%，與同時(shí)添加FSH和FBS處理組的結(jié)果差異不顯著。研究結(jié)果提示，Kp在牛卵母細(xì)胞中有表達(dá)，且在體外成熟過程中呈現(xiàn)規(guī)律性變化，其可提高牛卵母細(xì)胞體外成熟效率。

kisspeptin;牛卵母細(xì)胞;免疫熒光;體外成熟

Kisspeptin(Kp)是KiSS-1基因編碼的一種多膚,最初于1996年LEE等人在惡性黑色素瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn),其作用是抑制新陳代謝［1］。2003年,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Kp在哺乳動(dòng)物初情期啟動(dòng)上起著關(guān)鍵的“把門”作用［2-4］。目前研究已證實(shí),Kp主要在下丘腦表達(dá),其可與其特異性受體GPR54(G protein-coupled receptor 54)結(jié)合,刺激促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放,進(jìn)而促進(jìn)促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的釋放,對(duì)哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)起中樞調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn),Kp除在下丘腦表達(dá)外,在卵巢也有表達(dá)［5-7］。對(duì)豬和小鼠的研究表明,Kp和GPR54在卵母細(xì)胞上有表達(dá),添加Kp僅可促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟［8］,但對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟無作用［9］。近年來,對(duì)牛的研究表明,Kp在牛胎盤中表達(dá)且可促進(jìn)胎盤子葉上皮細(xì)胞的增殖［10］;注射外源Kp可促進(jìn)卵泡發(fā)育［11］。但Kp在牛卵母細(xì)胞上是否有表達(dá),其在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮何種生物學(xué)作用,目前尚不清楚。本研究利用免疫熒光和體外培養(yǎng)技術(shù),研究了Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)規(guī)律,并檢測(cè)了添加外源Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響,以期明確其功能。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養(yǎng)液的配制 Kp購自Calbiochem公司;FSH購自寧波市三生藥業(yè)有限公司;一抗(山羊抗體)購自Santa cruz biotechnology公司;二抗(羅丹明標(biāo)記兔抗山羊抗體)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。卵母細(xì)胞緩沖液采用HEPES,血清為胎牛血清(FBS),基礎(chǔ)培養(yǎng)液為TCM-199+60 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素,FSH處理劑量為10 μg/mL,溶液用微孔直徑為0.22 μm的濾膜過濾后使用。

1.2 卵母細(xì)胞的獲取 卵巢樣品取自長春市清真肉業(yè)屠宰場(chǎng),保存在30～36℃的生理鹽水中,2～6 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將樣品用生理鹽水清洗3次以上,采用抽吸法獲取卵母細(xì)胞。用裝有18號(hào)針頭的注射器吸取卵巢表面2～8 mm的卵泡,將抽取的卵泡液注入在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱的離心管中。收集全部卵泡液后,挑選3層以上卵丘細(xì)胞包裹、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)。

免疫熒光收集不同培養(yǎng)時(shí)間(0、6、12、18、24 h)的COC,用機(jī)械吹打方法去除卵丘細(xì)胞后放入到4%的多聚甲醛中固定30 min;將固定后的細(xì)胞放入含0.2%TritonX-100的PBS中滲透30 min;再放入封閉液(PBS+3%BSA+3%脫脂奶粉+0.18 mol/L甘氨酸+15%山羊血清)中封閉30 min;隨后按1∶50的稀釋比例在PBS中加入一抗,37℃孵育90 min;將孵育后的細(xì)胞加入按1∶200比例稀釋且有熒光素(Tetraethylrhodamineisothiocyanate,Tritc)標(biāo)記的二抗,37℃孵育60 min,于倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

卵母細(xì)胞體外成熟∶首先,將COC隨機(jī)分為5組,1組設(shè)為對(duì)照組,用TCM-199+雙抗培養(yǎng),其余4組在此基礎(chǔ)上分別添加1、10、102、103nmol/L Kp,進(jìn)行卵母細(xì)胞體外培養(yǎng),培養(yǎng)22 h后檢測(cè)卵母細(xì)胞成熟率。隨后,將成熟率最高組的Kp濃度作為添加Kp的最適濃度,將COC隨機(jī)分為6組,分別進(jìn)行以下處理∶TCM-199+Kp+雙抗;TCM-199+FSH+雙抗;TCM-199+FSH+Kp+雙抗;TCM-199+Kp+FBS+雙抗;TCM-199+FBS+雙抗;TCM-199+雙抗。采用6孔板培養(yǎng),將挑選好的COC清洗后放入培養(yǎng)液中,每孔放入30～50個(gè)COC,培養(yǎng)液體積為800 μL,在38.5℃、5%CO2且飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成熟,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,利用One-Way ANOVA分析不同處理組間差異的顯著性,＜0.05為差異顯著,＜0.01為差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)規(guī)律 由圖1可知,Kp在卵母細(xì)胞整個(gè)體外成熟過程中均有表達(dá),且表達(dá)量存在明顯差異,體外成熟0～12 h,Kp表達(dá)量逐漸增加,12～24 h,Kp表達(dá)量下降。

圖1 Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)規(guī)律

2.2 Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響 為明確Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的作用,首先研究了1、10、102、103nmol/L的Kp對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟率的影響。由表1可知,Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的作用存在明顯的劑量效應(yīng),添加10 nmol/L Kp組的卵母細(xì)胞成熟率最高,與其他4組差異極顯著(＜0.01),但所有添加Kp組的卵母細(xì)胞成熟率均極顯著高于對(duì)照組(＜0.01)。根據(jù)上述結(jié)果,確定10 nmol/L為添加外源Kp的最適濃度。

如表2所示,在無FBS的條件下,Kp組與Kp+FSH組的卵母細(xì)胞成熟率較高,且兩組間差異不顯著(＞0.05),但均極顯著高于只添加FBS組(＜0.01);而同時(shí)添加FBS和Kp時(shí),成熟率較低,與Kp組差異極顯著(＜0.01)。

表1 添加不同濃度Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表 2Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

3 討 論

本研究通過免疫熒光技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)Kp在牛卵母細(xì)胞中有表達(dá),這與以往的研究結(jié)果類似。Saadeldin等［8］利用PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)Kp在豬卵母細(xì)胞上表達(dá),Rocha等［9］利用PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程Kp有表達(dá),Castellano等［12］利用免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)Kp在小鼠卵母細(xì)胞上有表達(dá)。關(guān)于Kp在卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)規(guī)律,對(duì)豬的研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)26～30 h有表達(dá),而其他時(shí)段不表達(dá)［8］;對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)減數(shù)分裂時(shí)卵母細(xì)胞Kp表達(dá)顯著上調(diào),而當(dāng)卵母細(xì)胞發(fā)育到MI期時(shí)Kp表達(dá)量顯著下降,且發(fā)育到MII期表達(dá)量進(jìn)一步下降［9］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中均有表達(dá),且表達(dá)量在0～12 h增加, 12～24 h顯著下降。上述結(jié)果的差異可能與物種差異有關(guān)。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Kp可能在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中執(zhí)行某種功能。為明確其功能,首先利用體外成熟試驗(yàn)研究了添加不同濃度Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟率的影響。研究結(jié)果表明,添加不同濃度的Kp均可顯著提高牛卵母細(xì)胞成熟率,但添加10 nmol/L的Kp作用效果顯著高于其他濃度處理,提示Kp對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響存在明顯的劑量效應(yīng)。而對(duì)豬的研究表明,添加不同濃度Kp(0.5×10-6、1×10-6、2×10-6、4×10-6mol/L)對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的作用無顯著差異［8］,這可能是由于物種、培養(yǎng)液成分和劑量的選擇等實(shí)驗(yàn)條件差異造成的。為分析添加Kp是否可用于牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的優(yōu)化,進(jìn)一步比較了添加10 nmol/L的Kp與不同組分培養(yǎng)液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟率的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與基礎(chǔ)液添加FBS相比,基礎(chǔ)液中單獨(dú)添加10 nmol/L的Kp可顯著提高牛卵母細(xì)胞成熟率,且與基礎(chǔ)液中添加FSH和FBS結(jié)果差異不顯著。研究結(jié)果提示,添加10 nmol/L的Kp可替代培養(yǎng)液中添加FSH和FBS進(jìn)行牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng),即可優(yōu)化牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系,使培養(yǎng)液中不含激素和血清,但要想在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中應(yīng)用Kp,還需研究Kp處理獲得的成熟卵母細(xì)胞在體外受精和早期胚胎發(fā)育的實(shí)際效果。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),Kp與FBS同時(shí)添加,反而會(huì)降低卵母細(xì)胞成熟率,其原因有待于進(jìn)一步研究。對(duì)豬的研究表明,培養(yǎng)液中同時(shí)添加FSH和Kp也可提高卵母細(xì)胞成熟率,且可上調(diào)MOS、GDF9和BMP15基因的表達(dá)量［8］,而這些基因是卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵基因［13］,但單獨(dú)添加Kp并不能提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率。顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞成熟具有重要作用,本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn),Kp可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞增殖和孕激素的分泌［14］,Kp也可能通過這一途徑提高牛卵母細(xì)胞成熟率。由于相關(guān)報(bào)道極少,且現(xiàn)有各報(bào)道中實(shí)驗(yàn)條件差異較大,添加10 nmol/L的Kp促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)Kp在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性變化,且添加外源Kp可提高牛卵母細(xì)胞的體外成熟效率。

［1］ Lee J,Miele M,Hicks D,et al.KiSS-1,a novelhuman malignant melanoma metastasis-suppressor gene［J］.J Natl Can I, 1996,88(23):1731-1737.

［2］ de Roux N,Genin E,CarelJ,etal.Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54［J］.P Natl Acad Sci USA,2003,100(19): 10972-10976.

［3］ Funes S,Hedrick J,Vassileva G,et al.The KiSS-1 receptor GPR54 is essentialforthe developmentofthe murine reproductive system［J］.BiochemBioph Res Co,2003,312(4):1357-1363.

［4］ Seminara S,Messager S,Chatzidaki E,et al.The GPR54 gene as a regulator of puberty［J］.NEJM,2003,349(17):1614-1627.

［5］ Castellano J M,Gaytan M,Roa J,et al.Expression of KiSS-1 in rat ovary:putative local regulator of ovulation?［J］.Endocrinology, 2006,147(10):4852-4862.

［6］ 劉萍,王海飛,汪勁能,等.Kiss-1基因在豬初情期下丘腦-垂體-卵巢軸中的定位研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(15): 6324-6327.

［7］ 王軍,孫蕾,周海柱,等.發(fā)情周期不同階段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢上表達(dá)規(guī)律的研究［J］.中國畜牧雜志,2012,48(21):32-34.

［8］ Saadeldin I M,Koo O J,Kang J T,et al.Paradoxical effects of kisspeptin:it enhances oocyte in vitro maturation but has an adverse impact on hatched blastocysts during in vitro culture［J］. Reprod Fertil Dev,2012,24(5):656-668.

［9］ Rocha M,Ding J,Lehman M,et al.Kisspeptin and kisspeptin receptor are expressed in mouse oocytes and participate in meiosis resumption［J］.Fertil Steril,2012,98(3):S22.

［10］Martino N A,Rizzo A,Pizzi F,et al.Effects of kisspeptin-10 on in vitro proliferation and kisspeptin receptor expression in primary epithelial cell cultures isolated from bovine placental cotyledons of fetuses at the first trimester of pregnancy［J］.Theriogenology,2014,11:033.

［11］Yousuke N,Keisuke N,Shohei S,et al.Effects of Full-Length Kisspeptin Administration on Follicular Development in Japanese Black Beef Cows［J］.J Reprod Dev,2013,59:588-594.

［12］Castellano J M,Gaytan M,Roa J,et al.Expression of KiSS-1 in ratovary:putativelocal regulatorofovulation?［J］.Endocrinology, 2006,147(10):4852-4862.

［13］McNatty K P,Juengel J L,Reader K L,et al.Bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 co-operate to regulate granulosa cell function in ruminants［J］.Reproduction, 2005,129,481-487.

［14］趙靜,王軍.KiSS-1/GPR54系統(tǒng)在卵巢的表達(dá)和功能研究進(jìn)展［J］.中國畜牧雜志,2014,50(21):82-83.

S823.3

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0019-03

2015-01-12;

2015-03-13

吉林省肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系,吉林省科技廳重大科技攻關(guān)專項(xiàng) (20140203016NY);吉林省科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃(20150519018JH);吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204074NY)

賀明(1989-),男,吉林長春人,在讀碩士,研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖調(diào)控,E-mail:hemingbb@126.com

*通訊作者:呂文發(fā),教授,博導(dǎo),E-mail:wenfa2004@163.com