汪加興，賈啟濤，李帥峰，梁愛心，楊利國，張淑君

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

汪加興，賈啟濤，李帥峰，梁愛心，楊利國，張淑君*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

抑制素(INH)主要是通過抑制促卵泡素(FSH)的合成與分泌來調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和精子發(fā)生，而INHα是其重要組成亞基。本實(shí)驗(yàn)室前期將α基因3個RNAi片段(分別命名為B、C和M)整合到小鼠基因組中得到了轉(zhuǎn)基因小鼠;本研究分析這3個RNAi片段在轉(zhuǎn)基因雌鼠中的抑制效果及對繁殖性能的影響。結(jié)果表明:B、C和M片段在轉(zhuǎn)基因雌鼠F3代中遺傳率分別為81.3%、51.1%和77.6%，其3周時抑制效率分別為27.5%、96.1%和75.1%;轉(zhuǎn)基因雌鼠F0代的第1胎產(chǎn)仔數(shù)均高于野生型，而F1、F2代B和M片段升高，C片段減少，但差異不顯著(＜0.05)，此外其F2代3周子鼠卵巢重和體重顯著高于野生型(＜0.05)。綜上，INH是體內(nèi)必需的重要調(diào)控基因，不能缺少，過多抑制反而會降低其繁殖性能;遺傳穩(wěn)定性可能隨著干擾抑制效率的提高而降低。

INHα;RNAi;卵泡發(fā)育;轉(zhuǎn)基因小鼠

抑制素(INH)作為一種糖蛋白激素,是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的成員,該家族參與體內(nèi)各種細(xì)胞發(fā)育和分化功能的調(diào)節(jié)［1］。抑制素INH由2個不同的亞單位即α亞基和β亞基經(jīng)二硫鍵連接而形成異源二聚體,而β亞基又分為βA和βB 2種形式,故抑制素有抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB)2種形式。雄性體內(nèi),抑制素能抑制精原細(xì)胞的生成并減少精原細(xì)胞的數(shù)量,降低精液生成量［2］;雌性體內(nèi),抑制素對維持卵泡的正常發(fā)育非常重要［3］。此外,INH還參與胚胎發(fā)育［4］、腫瘤［5-7］等生理過程的調(diào)控。

RNAi即RNA干擾,是指將外源雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后引起與其序列同源的特異基因mRNA降解的現(xiàn)象,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種形式［8］。Han等［9］利用RNAi技術(shù)對小鼠垂體前葉細(xì)胞進(jìn)行了α基因的沉默,發(fā)現(xiàn)沉默INH影響了細(xì)胞的增殖、凋亡等生命活動。

外源片段導(dǎo)入有多種方法,本實(shí)驗(yàn)通過顯微注射的方法將干擾抑制素基因的RNAi片段導(dǎo)入到小鼠體內(nèi),成功獲得了不同干擾片段(分別命名為B、C和M)的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過分析α基因RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的siRNA干擾抑制效應(yīng)及其對生殖器官和繁殖性狀的影響,為進(jìn)一步研究抑制素基因功能和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠是FVB型小鼠,轉(zhuǎn)基因陽性小鼠由廣州賽業(yè)生物有限公司通過顯微注射的方式獲得。接收轉(zhuǎn)基因小鼠后在恒溫條件下(20～25℃)和濕度(60%～75%)條件下進(jìn)行單間飼養(yǎng)管理,提供12 h光照/黑暗的光照周期。

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠繁育 對后期實(shí)驗(yàn)所需的小鼠均采用自繁。設(shè)計不同干擾水平陽性小鼠之間配種,每個實(shí)驗(yàn)組6～7窩,分析與野生型小鼠之間在產(chǎn)仔數(shù)、初生重、存活率等方面的差異。每個鼠籠里放置一公一母,3 d換1次水,7 d換1次墊料;母鼠產(chǎn)仔后將雄鼠分開,統(tǒng)計產(chǎn)仔數(shù)、出生重等數(shù)據(jù),21 d后子鼠斷奶后重新與雄鼠合籠。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠后代陽性檢測 母鼠哺乳21 d后剪子鼠尾巴2～3 cm,采用傳統(tǒng)DNA提取法提取基因組DNA。所提的DNA利用PCR的方法來檢測是否為陽性。所需要的PCR引物序列及相關(guān)參數(shù)見表1。

1.4 RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR 利用Trizol試劑(Vitrogen)根據(jù)說明書從經(jīng)PCR檢測為陽性的3周和6周雌鼠卵巢中分離卵巢總RNA,采用RT-PCR法合成cDNA以及使用SYBR Green(SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR預(yù)混QPK-201,日本東洋紡公司)進(jìn)行實(shí)時定量PCR。特異性QPCR在羅氏480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行。實(shí)時QPCR反應(yīng)后,樣品通過熔解曲線的分析以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的純度。QPCR引物及相關(guān)參數(shù)見表2,測定每個樣品中目的基因mRNA和管家基因ACTB的CT值。各基因的相對mRNA表達(dá)水平使用下式估算∶2-ΔΔCT［10］。

表1 轉(zhuǎn)基因陽性后代小鼠檢測引物序列及相關(guān)參數(shù)

表2 qPCR相關(guān)引物及參數(shù)

1.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。利用SPASS統(tǒng)計分析系統(tǒng)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P＜0.05的值被認(rèn)為是顯著。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n≥3)。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的RNAi干擾片段的檢測及遺傳率分析 采用PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠后代中的RNAi干擾片段(圖1),3個RNAi干擾片段均能夠遺傳給下一代。不同的干擾片段在后代中的遺傳存在差異,3個片段在后代中的陽性率為B＞M＞C(P＞0.05,圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)基因后代子鼠陽性PCR檢測

圖2 F3代不同干擾片段在轉(zhuǎn)基因小鼠中遺傳穩(wěn)定性的分析

2.2 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的產(chǎn)仔數(shù)、初生重與3周齡體重的分析 通過統(tǒng)計和分析不同片段轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)3代第1胎產(chǎn)仔數(shù)。與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠后代的產(chǎn)仔數(shù)得到提高,但差異不顯著,并且表現(xiàn)為B和M片段在F1、F2代有所增加而C片段反而降低(P＞0.05,表3)。此外,轉(zhuǎn)基因小鼠后代出生平均體重相對于野生型均有所提高,其中M片段的轉(zhuǎn)基因小鼠后代顯著提高平均出生體重(P＜0.05)。此外,B片段和M片段F3代轉(zhuǎn)基因小鼠分別極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)提高了3周體重(表4)。

2.3 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的卵巢重量的分析 對轉(zhuǎn)基因小鼠F3代雌鼠3周卵巢發(fā)育進(jìn)行分析,轉(zhuǎn)基因小鼠的卵巢重量均有所提高,其中B和M片段轉(zhuǎn)基因小鼠極顯著提高了卵巢重量,并且卵巢增長高低順序?yàn)锽＞M＞C,這與RNAi干擾效率相反(P＜0.01,表4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠卵巢中促卵泡素受體FSHR基因mRNA表達(dá)水平的分析 利用qPCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因雌性小鼠卵巢中的FSHR基因mRNA表達(dá)水平,與野生型相比,3周齡轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的FSHR基因mRNA表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05);6周齡時則有所上升,其中B片段轉(zhuǎn)基因小鼠FSHR上升水平相對于C、M片段較高(圖3)。

表3 連續(xù)3代轉(zhuǎn)基因陽性雌性小鼠第1胎產(chǎn)仔數(shù)(每組平均2～4窩)

表4 F3代雌鼠3周體重、卵巢重數(shù)據(jù)(n=4)

圖3 F3代3～6周轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的FSHR和6周齡時ERβ基因mRNA表達(dá)水平

3 討 論

圖4 F3代不同周齡轉(zhuǎn)基因陽性雌鼠抑制素α基因的表達(dá)

3.1 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的RNAi干擾片段的遺傳穩(wěn)定性 RNAi技術(shù)作為一種新型研究基因功能、干擾劣勢或不利基因表達(dá)的技術(shù),得到了廣泛應(yīng)用。Stein等［10］將Mos基因的RNAi顯微注射到小鼠成熟的卵母細(xì)胞中,導(dǎo)致了Mos基因的特異降解。將特異性敲除抑制素-α基因的RNAi注射到小鼠體內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。研究表明,干擾片段可以穩(wěn)定遺傳給下一代。Shi等［11］通過睪丸注射的方法,將構(gòu)建的以sp3111為靶基因的轉(zhuǎn)基因RNAi載體注射到雄性小鼠睪丸中,30 d后與野生雌性小鼠交配獲得了sp3111基因表達(dá)量降低的轉(zhuǎn)基因子鼠［12］。

本實(shí)驗(yàn)中該干擾片段均遺傳率達(dá)到了50%～80%,單胎遺傳率甚至出現(xiàn)100%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象是由于配子產(chǎn)生過程中經(jīng)歷2次減數(shù)分裂,并且存在同源重組現(xiàn)象等造成后代配子中不存在RNAi片段,從而出現(xiàn)陰性小鼠。對于異源雜交對RNAi穩(wěn)定遺傳的影響需進(jìn)一步分析研究。此外,干擾片段干擾效率與其遺傳穩(wěn)定性存在一定的關(guān)系,表現(xiàn)為高干擾效果的片段反而具有較低的遺傳穩(wěn)定性,這可能是由于插入基因組內(nèi)的外源片段拷貝數(shù)較多,在形成配子過程中引起體內(nèi)自身的基因組保護(hù)機(jī)制,從而降低其遺傳性。

3.2 抑制素-α基因的RNAi片段轉(zhuǎn)基因雌性小鼠卵泡發(fā)育加快及體重的提高 雌性動物3周斷奶后進(jìn)入卵泡發(fā)育階段,到6周時達(dá)到性成熟。FSH是促進(jìn)卵泡發(fā)育的一個非常重要的激素,而抑制素主要的作用是抑制FSH的合成與分泌來調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育與精子發(fā)生,降低抑制素-α表達(dá)水平后促進(jìn)了雌性小鼠卵巢的發(fā)育,表現(xiàn)為卵泡數(shù)增多,加快卵泡的成熟過程。其原因可能為在卵泡發(fā)育過程中前半期以激活素(ACT)作用為主,ACT促進(jìn)FSH和LH受體表達(dá),提高芳香化酶活性,導(dǎo)致FSH合成分泌增加［13］。而抑制素能夠競爭性結(jié)合ACT結(jié)合受體ACTRⅡ,降低了ACT促FSH分泌的作用。RNAi發(fā)揮作用后降低了抑制素表達(dá)水平,造成對ACT競爭性抑制作用減弱,提高了FSH水平,提高了其促卵泡發(fā)育的能力,但3周FSHR水平顯著下降,這其中機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外,6周性成熟時期FSHR表達(dá)水平相對于野生型沒有變化且與3周相比趨勢有所上升,這可能與FSH和FSHR結(jié)合效率以及FSH對FSHR表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)相關(guān)。此外,6周齡卵巢GC上雌激素受體(ERβ)顯著下降,研究表明在卵泡發(fā)育后期ER主要形式為ER-β［14］,敲除ER-β的KO(Knockout)小鼠能正常發(fā)育、生長且與野生型無差異,但是表現(xiàn)為產(chǎn)仔數(shù)減少［15］,其原因可能是由于在排卵期低水平的ER降低了垂體對GnRH的敏感性導(dǎo)致LH分泌降低造成的。另外轉(zhuǎn)基因小鼠后代產(chǎn)仔能力還可能與雄性精子品質(zhì)等方面有關(guān),其中具體機(jī)制需要對RNAi片段是否對LH存在影響以及對ER表達(dá)調(diào)控的機(jī)制做進(jìn)一步深入分析。一定程度上降低抑制素的表達(dá)水平可以顯著促進(jìn)卵巢發(fā)育及體重的提高,而過多的降低抑制素的表達(dá)水平反而會降低其繁殖性能,表明抑制素是體內(nèi)所必需的生殖激素之一。

因此,由于RNAi干擾抑制了抑制素-α基因而降低了抑制卵泡發(fā)育的功能,從而可能促進(jìn)卵巢中顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞生長發(fā)育,提高卵巢重量和卵巢發(fā)育。

4 結(jié) 論

特異性干擾抑制素α基因的RNAi片段成功導(dǎo)入到小鼠基因組內(nèi),并能較穩(wěn)定地遺傳;導(dǎo)入的RNAi片段發(fā)揮了干擾作用降低了抑制素-α基因的表達(dá),從而促進(jìn)了卵巢和卵泡的發(fā)育以及提高了小鼠的生長。

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Analysis of Interference Effects and Reproductive Performance of RNAi in INHα Silencing Transgenic Mice

WANG Jia-xing,JIA Qi-tao,LI Shuai-feng,LIANG Ai-xin,YANG Li-guo,ZHANG Shu-jun*
(Key Lab of Agricultural Animal Genetics,Breeding and Reproduction of Ministry of Education, Huazhong Agricultural University,Hubei Wuhan 430070,China)

The role of inhibin,transforming growth factor-β (TGF-β)superfamily member,is to regulate folliculardevelopment and spermatogenesis through the inhibition of synthesis and secretion of follicle-stimulating hormone.Our previous studies,three RNAi fragments interfering INHgene(named B,C and M)have integrated into mouse genome and got transgenic mice.This study analyzed the interference effects of three segments within the mouse genome and its effects on reproductive performance.The results showed that the genetic rates of B,C and M fragments in F3generation transgenic female mice were 81.3%,77.6%and 51.1%and inhibition efficiency of three-week were 27.5%,96.1%and 75.1%,respectively;On the first litter size,F0generation of transgenic female mice was higher than wild-type,and F1,F2generation of B and M segments increased,while C fragment reducted,both have no significant difference,in addition to the ovarian weight and body weight of three-week-age offspring in F2generation were significantly higher than that of wild-type.In conclusions,INH is an important regulatory gene in vivo which must not be missing,too much inhibition reduces the reproductive performance;genetic stability may decrease with the high interference efficiency.

INH α;RNAi;ovary development;transgenic mice

S865.1+30.3

A文獻(xiàn)標(biāo)識碼:0258-7033(2015)11-0001-04

2014-10-21;

2014-12-27

黃鶴英才項(xiàng)目;歐盟F7項(xiàng)目(PIIF-GA-2012-328205、PIIFR-GA-2012-912205、FP7-KBBE-2013-7-613689)

汪加興(1990-),男,碩士,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究,E-mail:wangjiaxingabcd@163.com

*通訊作者:張淑君,E-mail:sjxiaozhang@mail.hzan.edn.cn