郭燕珊，吳　昊，鄭力恒，尚玉攀，屠　美，張嘉晴△(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系，附屬第一醫(yī)院廣州華僑醫(yī)院骨科，理工學(xué)院生物材料系，廣東廣州506;澳門醫(yī)學(xué)科技研究協(xié)會(huì)，中國(guó)澳門999078)

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聚合物/液晶細(xì)胞模型的構(gòu)建及其表面彈性對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞黏附的影響*

郭燕珊1，吳昊2，鄭力恒4，尚玉攀1，屠美3，張嘉晴1△
(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系，2附屬第一醫(yī)院廣州華僑醫(yī)院骨科，
3理工學(xué)院生物材料系，廣東廣州510632;4澳門醫(yī)學(xué)科技研究協(xié)會(huì)，中國(guó)澳門999078)

［摘要］目的:構(gòu)建聚合物/液晶細(xì)胞模型，探究其表面彈性對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞黏附情況的影響。方法:溶劑揮發(fā)致相分離方法構(gòu)建聚合物/液晶細(xì)胞模型，通過(guò)偏光顯微鏡、掃描式電子顯微鏡及X射線衍射觀察細(xì)胞模型的表面特征。全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，通過(guò)表面因子檢測(cè)和誘導(dǎo)其成骨成脂分化進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)3代后分4組:純PU空白對(duì)照組，10%膜組，30%膜組和50%膜組。接種細(xì)胞密度為5×107/L，待細(xì)胞貼壁24h后作細(xì)胞骨架染色處理，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞附著在材料上的情況并拍照。結(jié)果:溶劑揮發(fā)致相分離方法成功構(gòu)建3種不同硬度的聚合物/液晶細(xì)胞模型;表面因子檢測(cè)顯示CD29、CD44、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34和CD45呈陰性表達(dá);經(jīng)過(guò)茜素紅S染色和油紅O染色，成骨成脂分化形成的鈣結(jié)節(jié)和脂滴都顯而易見;細(xì)胞骨架染色拍攝結(jié)果顯示，純PU對(duì)照組、10%膜組和30%膜組上的細(xì)胞鋪展面積較廣，肌動(dòng)蛋白微絲和細(xì)胞核清晰明顯;而50%膜組的細(xì)胞鋪展面積較小，細(xì)胞核雖較清晰，但是肌動(dòng)蛋白微絲卻模糊不清。結(jié)論:合適液晶含量的聚合物/液晶生物膜能支持大鼠骨髓干細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，而液晶含量過(guò)高則抑制細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。

［關(guān)鍵詞］聚合物/液晶細(xì)胞模型;大鼠骨髓干細(xì)胞;細(xì)胞骨架染色

［修回日期］2015-03-04

Development of cell model of polymer/liquid crystal and effect of their elasticity on adhesion of rBM-MSCs

GUO Yan-shan1，WU Hao2，ZHENG Li-heng4，SHANG Yu-pan1，TU Mei3，ZHANG Jiaqing1
(1Department of Biochemistry，School of Medicine，2Department of Orthopedics，The First Affiliated Hospital，3Department of Biological Material，Jinan University，Guangzhou 510632，China;4Macau Medical Science＆Technology Research Association，Macau 999078，China.E-mail: zhangjiaqing@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To develop the cell model of polymer/liquid crystal and to study the effect of their elasticity on the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs).METHODS: Using the method of solvent evaporation induced phase separation，the cell model of polymer/liquid crystal was constructed.The surface morphology and phase separation structure were determined by polarized optical microscopy (POM)，scanning electron microscopy (SEM) and small angle X-ray scattering (SAXS).rBM-MSCs were separated and expanded by adherent culture.The surface markers of rBM-MSCs were detected by flow cytometry.The cells were induced to osteogenic differentiation and adipogenic differentiation for 2 weeks.After 3 passages，the cells were divided into 4 groups，including total PU control group，10% membrane group，30% membrane group and 50% membrane group.The cells were then incubated with rhodamine phalloidin for cytoskeleton staining and were observed under the confocal laser scanning microscope after cultured for 24 h.RESULTS: The cell model of polymer/liquid crystal was constructed successfully using the method of solvent evaporation induced phase separation.Flow cytometry results showed that the rBM-MSCs positively expressed CD29，CD44 and CD90，and negatively expressed CD34 and CD45.After stained with alizarin red S and oil red O，the calcium nodule and lipid droplets in rBM-MSCs were observed obviously.The cytoskeleton staining result indicated that the area in total PU control group，10% membrane group and 30% membrane group were greater，and the actin microfilaments were also clearer thanthat in 50% membrane group.CONCLUSION: The cell model with suitable content of liquid crystal made a contribution to the rBM-MSCs’adhesion，but too much liquid crystal inhibits cell adhesion.

［KEY WORDS］Cell model of polymer/liquid crystal; Rat bone marrow mesenchymal stem cells; Cytoskeleton staining

細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供物理空間，為細(xì)胞的黏附提供力學(xué)支撐并傳遞化學(xué)、力學(xué)以及生物學(xué)信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控細(xì)胞的表型，從而極大地影響再生組織的結(jié)構(gòu)和功能［1］。研究表明用于組織工程的生物材料，種子細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)行為都造成不同的影響，而生物材料的表面特性所占的地位尤為重要［2-5］。這就意味著，控制材料的表面特性可能引起細(xì)胞生物特性的改變［6-8］。

近年來(lái)，隨著對(duì)干細(xì)胞性能了解的逐漸深入，其多能性分化潛能的可控性逐漸提高，干細(xì)胞已被更加廣泛地用作組織工程中的種子細(xì)胞。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBM-MSCs)是分離自大鼠骨髓中的具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，包括骨、軟骨、筋腱、韌帶、肌肉和脂肪等，且存在取材方便、體外培養(yǎng)技術(shù)成熟、具有自體移植潛能等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域備受矚目的種子細(xì)胞［9-12］。

干細(xì)胞對(duì)其細(xì)胞外基質(zhì)的固有性質(zhì)非常敏感，基質(zhì)彈性誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化已經(jīng)成為一種新型的、敏感性非常高的細(xì)胞調(diào)節(jié)因素。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)具有適宜彈性模量的聚合物/液晶細(xì)胞模型，研究基質(zhì)表面彈性對(duì)rBM-MSCs黏附生長(zhǎng)等細(xì)胞行為的影響，是組織工程用生物材料設(shè)計(jì)的一個(gè)新思路。

材料和方法

1材料和試劑

6～8周SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心) ;低糖DMEM(Gibco) ;特級(jí)胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所) ;青、鏈霉素、L-谷氨酰胺(Sigma) ;細(xì)胞骨架染色材料均購(gòu)自Cytoskeleton。

2方法

2.1聚合物/液晶生物膜制作羥丙基纖維素衍生物液晶(OPC)/聚氨酯(PU)復(fù)合膜由溶劑揮發(fā)致相分離方法制得，具體而言，一定量的羥丙基纖維素衍生物液晶充分溶解在一定體積的四氫呋喃(THF)中使液晶的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為3%，形成均相溶液后，按不同比例加入干燥PU顆粒，磁力攪拌過(guò)夜使PU充分溶解。均相溶液在室溫下澆注于Φ 60的玻璃培養(yǎng)皿中，蓋上配套的培養(yǎng)皿，室溫下放置于通風(fēng)櫥中至溶劑充分揮發(fā)。把復(fù)合膜轉(zhuǎn)移到真空干燥箱中，在37℃、－1 MPa下減壓干燥24 h使溶劑完全揮發(fā)，得到復(fù)合膜厚度約為200 μm。本實(shí)驗(yàn)中制備了不同比例的OPC/PU復(fù)合膜，其中OPC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、30%和50%，分別記作10%膜、30%膜和50%膜。構(gòu)建成功后，分別用偏光顯微鏡、掃描式電子顯微鏡及X射線衍射觀察聚合物/液晶生物膜的表面特征。

2.2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)無(wú)菌條件下頸部脫臼法處死SD大鼠，75%乙醇浸泡5分鐘。用手術(shù)剪剪開四肢皮膚取出股骨與脛骨，小心剔除肌肉與肌腱，接著用手術(shù)剪剪開骨的兩端，用1 mL一次性注射器吸取無(wú)血清L-DMEM沖洗骨髓腔，至股骨、脛骨發(fā)白為止。收集沖洗液至15 mL離心管中，1 500 r/min離心5min，棄去上清液，加入12 mL含血清20%、青-鏈霉素1%、谷氨酰胺1%的LDMEM完全培養(yǎng)基吹打至單細(xì)胞懸液。接種在75T透氣培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，待細(xì)胞融合至90%左右，以1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面因子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rBM-MSCs的表面標(biāo)志:取培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，0.25%的胰酶消化，獲得單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L;加入相應(yīng)的表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的抗體，冰上避光孵育30 min。1 500 r/min，4℃離心5 min; PBS(含1 g/L BSA)洗滌細(xì)胞2次;加入300～400 μL PBS重懸細(xì)胞，過(guò)45 μm篩網(wǎng)后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 rBM-MSCs分化能力鑒定培養(yǎng)至第3代后的rBM-MSCs，經(jīng)胰酶消化后以1×109/L的密度接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后更換為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的低糖DMEM，0.52×10－7g/L地塞米松，0.89×10－2g/L抗壞血酸，3.06 g/L β-甘油磷酸鈉;成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，0.11×10－3g/L IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，0.52×10－6g/L地塞米松，0.58×10－2g/L胰島素;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨成脂分化誘導(dǎo)時(shí)每隔3 d更換1次誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)2周后分別進(jìn)行茜素紅S染色和油紅O染色。

2.5細(xì)胞骨架染色調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，均勻種于不同的實(shí)驗(yàn)組上(純PU對(duì)照組，10%膜組，30%膜組和50%膜組)。待細(xì)胞貼壁24 h后，去掉培養(yǎng)液，用多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，固定完畢后用PBS輕輕清洗1遍;室溫下加入通透性緩沖液處理5 min，再用PBS沖洗1遍;把所有樣品移至潮濕暗房中進(jìn)行rhodamine phalloidin染色30 min，染色完畢，接著用PBS沖洗3遍;再用DAPI進(jìn)行復(fù)染DNA 5 min，PBS沖洗3遍;把膜移至載玻片上，注意正面朝上，往膜上滴加1滴抗淬滅劑，蓋上蓋玻片后，用透明指甲油進(jìn)行封片;染色處理完畢之后黑暗保存于4℃中，待進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，采用Leven’s方差齊性檢驗(yàn)與獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1聚合物/液晶細(xì)胞模型的構(gòu)建

1.1偏光顯微鏡檢測(cè)復(fù)合膜表面特征當(dāng)液晶混合聚氨酯后，所有的PU/OPC復(fù)合膜上都出現(xiàn)分散良好的雙折射現(xiàn)象，展現(xiàn)出液晶相形成的亮點(diǎn)。OPC域的大小和數(shù)量隨著液晶結(jié)構(gòu)域的增加而增加。OPC域的點(diǎn)狀均勻地分布在PU/OPC復(fù)合膜上。上述結(jié)果表明當(dāng)OPC結(jié)合到PU基底上后，復(fù)合膜上發(fā)生的相分離源于兩者組分的不相容性。OPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含了循環(huán)碳和柔性側(cè)鏈。OPC展現(xiàn)出的半剛性鏈結(jié)構(gòu)是因?yàn)樗^長(zhǎng)的柔性側(cè)鏈，同時(shí)，這些長(zhǎng)的側(cè)鏈可以與PU鏈的柔性部分相互纏繞，這促進(jìn)了OPC域在復(fù)合膜上的均勻分布，見圖1。

Figure 1.Surface morphology and phase separation structure investigated by polarized optical microscopy.圖1偏光顯微鏡觀察生物膜的表面特征

Figure 2.Surface morphology and phase separation structure investigated by scanning electron microscopy.圖2掃描式電子顯微鏡觀察生物膜的表面特征

1.2掃描式電子顯微鏡觀察復(fù)合膜表面特征所有膜的表面形狀是通過(guò)掃描電鏡觀察得到的。純的PU基本沒(méi)有任何結(jié)構(gòu)，表面平整，而復(fù)合膜表面粗糙，且有一個(gè)兩相形狀。這相互交錯(cuò)的網(wǎng)狀織構(gòu)和膽甾型液晶的特征油狀結(jié)構(gòu)非常相像。從PU/OPC復(fù)合膜來(lái)看，當(dāng)液晶含量比較低時(shí)，OPC域分散在膜上顯示出良好的指紋結(jié)構(gòu)，這代表著少含量的液晶排列成有序的相態(tài)。隨著OPC含量的增加，指紋構(gòu)型逐漸變大、變密，并相互連接在一塊，見圖2。 1.3 X射線衍射觀察復(fù)合膜表面特征對(duì)于純PU膜，由于軟緞的排列，2θ在10°和20°的衍射峰是PU半結(jié)晶性的特征峰。純OPC的衍射圖譜上相近的位置也出現(xiàn)2個(gè)寬而平緩的衍射峰，這是由于高分子液晶分子排列的準(zhǔn)長(zhǎng)程序引起的。對(duì)于PU/OPC復(fù)合膜，相應(yīng)的峰隨著液晶含量的增加變得更加寬闊和扁平。這表明PU基底中引入的OPC可能會(huì)改變最初的結(jié)晶行為。有趣的是，當(dāng)PU/OPC復(fù)合膜中的OPC含量增至50%的時(shí)候，2θ在20°處的結(jié)晶峰幾乎消失。很有可能是在PU和OPC的復(fù)雜系統(tǒng)中，PU中硬段和軟段以及硬段和硬段之間的氫鍵在引入液晶相后部分?jǐn)嗔?，從而影響了PU的結(jié)晶度。PU的軟段可能會(huì)通過(guò)它們較長(zhǎng)的柔軟的側(cè)鏈纏繞在一起，這更加干擾了PU的結(jié)晶度。特別是當(dāng)OPC含量接近50%的時(shí)候，在基底上發(fā)生了很大程度的自聚集和形成了連續(xù)的液晶相。這樣，PU的結(jié)晶結(jié)構(gòu)很大程度上被破壞，并在2θ為20°處的衍射峰就消失了，見圖3。

Figure 3.Surface morphology and phase separation structure investigated by small angle X-ray scattering.圖3 X射線衍射觀察生物膜的表面特征

2 rBM-MSCs的分離與鑒定

2.1 rBM-MSCs的傳代、擴(kuò)增與純化全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離rBM-MSCs。將細(xì)胞懸液接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開始貼壁，72 h后進(jìn)行首次換液，此時(shí)可見梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，可見培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)呈克隆樣生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)越來(lái)越多。待細(xì)胞融合90%左右，約需14 d，經(jīng)0.25%的胰酶消化后，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，以1∶2的比例進(jìn)行傳代。首次細(xì)胞融合所需時(shí)間較長(zhǎng)，且早代的rBM-MSCs中存在較多的雜細(xì)胞;往后細(xì)胞融合相對(duì)較快，約每4～5 d進(jìn)行1次傳代。連續(xù)傳代3～4次后，rBM-MSCs趨于純化。此時(shí)細(xì)胞不但純度較高，且增殖能力旺盛，故本實(shí)驗(yàn)均采用第3代BMSCs進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理，見圖4。

Figure 4.Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells (×100).圖4不同代的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

2.2 rBM-MSCs表面標(biāo)記物表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs表達(dá)CD29、CD44和CD90的陽(yáng)性率分別為99.19%、95.59%和99.97%;而表達(dá)CD34和CD45的陽(yáng)性率分別為1.26% 和0.65%，見圖5。

Figure 5.The flow cytometry results of cell surface markers on rBM-MSCs at passage 3.圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)rBM-MSCs表面因子表達(dá)

2.3 rBM-MSCs的分化能力鑒定第3代rBMMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，用茜素紅S染色，可以看到大量紅色鈣化基質(zhì);同樣第3代rBM-MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后，用油紅O染色，可見細(xì)胞內(nèi)有明顯的紅色脂滴，表明本課題組所分離的細(xì)胞均具有向成骨和成脂分化的潛能，見圖6。

3 rBM-MSCs在生物膜上的貼壁狀況

Figure 6.Staining of osteogenic cells (alizarin red S staining，×100) and adipogenic cells (oil red O staining，×200).圖6培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs成骨和成脂分化

不同的細(xì)胞外基質(zhì)，影響著細(xì)胞的附著形態(tài)、延伸狀況以及細(xì)胞貼壁密度等［13］。本實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)不同OPC含量的聚合物/液晶生物膜對(duì)rBM-MSCs貼壁狀況的影響，我們將rBM-MSCs培養(yǎng)至第3代時(shí)，使用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，將細(xì)胞均勻種在含液晶10%、30%和50%的生物膜上，設(shè)純PU組作為空白對(duì)照組。由于生物膜的不透性，所以待細(xì)胞貼壁24 h后，使用rhodamine phalloidin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。染色完畢，在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行觀察并拍照，見圖7。結(jié)果顯示，純PU對(duì)照組，10%膜組和30%膜組上的rBM-MSCs呈現(xiàn)出明顯的應(yīng)力纖維，細(xì)胞鋪展面積較廣，另外，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白微絲細(xì)長(zhǎng)連續(xù)，細(xì)胞核清晰可見;而50%膜組上的rBMMSCs則呈現(xiàn)出橢圓形狀，且細(xì)胞鋪展面積普遍較小，同時(shí)，rBM-MSCs的細(xì)胞核明顯，但肌動(dòng)蛋白微絲模糊不清。明顯地，液晶含量適當(dāng)?shù)纳锬た梢灾С植⒋龠M(jìn)rBM-MSCs的貼壁黏附和成活，而液晶含量過(guò)高則不利于細(xì)胞的附著生長(zhǎng)。

Figure 7.Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells taken by confocal laser scanning microscopy.圖7不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞骨架染色圖

討論

近年來(lái)，天然的和合成的基質(zhì)已用于制作具有已知彈性模量(硬度)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，目的是研究如何控制細(xì)胞行為，即細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖和分化。而細(xì)胞和固體表面的相互作用通過(guò)控制表面化學(xué)、拓?fù)湫蚊蔡卣?、基質(zhì)材料的彈性和順從性及這些參數(shù)的整合已被工程化。因此，設(shè)計(jì)一種可展示柔軟性和堅(jiān)韌性的基質(zhì)材料作為軟物質(zhì)細(xì)胞模型，研究探索基質(zhì)彈性對(duì)細(xì)胞行為的影響對(duì)于組織工程用生物材料的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。已有報(bào)道顯示調(diào)控生物材料適宜的表面特性，具有維持細(xì)胞正常表型和功能，并且可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，活化，生長(zhǎng)，分化以及影響其分泌功能［14-17］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用溶劑揮發(fā)致相分離方法成功構(gòu)建聚合物/液晶生物膜，偏光顯微鏡檢測(cè)復(fù)合膜表面的結(jié)果表明當(dāng)OPC結(jié)合到PU基底上后，復(fù)合膜上發(fā)生的相分離源于兩者組分的不相容性。掃描式電子顯微鏡觀測(cè)復(fù)合膜表面結(jié)果顯示，隨著OPC含量的增加，指紋構(gòu)型逐漸變大和變密，并相互連接在一塊。X射線衍射觀察復(fù)合膜表面的結(jié)果顯示，對(duì)于PU/OPC復(fù)合膜，相應(yīng)的峰隨著液晶含量的增加變得更加寬闊和扁平，表明PU基底中引入的OPC可能會(huì)改變最初的結(jié)晶行為。

目前很多研究已表明，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具備提取方便，易于純化，擴(kuò)增能力強(qiáng)以及容易誘導(dǎo)向成骨方向分化等優(yōu)點(diǎn)［9-12］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，模仿已報(bào)道文獻(xiàn)中的分離方法，使用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法從大鼠股骨骨髓腔中分離rBM-MSCs，通過(guò)傳代培養(yǎng)純化細(xì)胞，獲得具有明顯梭狀形態(tài)的rBMMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面因子結(jié)果顯示CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的陽(yáng)性表達(dá)率均符合rBM-MSCs的特點(diǎn);除此之外，從誘導(dǎo)分化的結(jié)果看出所分離的細(xì)胞都具有向成骨成脂分化的潛能。因此，種種鑒定結(jié)果充分說(shuō)明了我們所分離的細(xì)胞就是rBM-MSCs。

最近的研究表明，不同硬度的細(xì)胞外基質(zhì)與機(jī)體內(nèi)肌動(dòng)蛋白的收縮性有密切關(guān)系［18-19］。細(xì)胞附著在生物材料上，會(huì)隨著附著表面的物理和化學(xué)性質(zhì)的不同而存在著很大的差異性。如附著材料的分子特性、硬度等都會(huì)對(duì)細(xì)胞貼壁的形態(tài)、密度、遷移特性以及基因表達(dá)等都會(huì)造成不同的影響［20-22］。本實(shí)驗(yàn)中同一時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，純PU對(duì)照組、10%膜組和30%膜組上的細(xì)胞呈現(xiàn)出鋪展面積較廣，肌動(dòng)蛋白微絲和細(xì)胞核清晰明顯;而50%膜組的細(xì)胞鋪展面積較小，細(xì)胞核雖較清晰，但是肌動(dòng)蛋白微絲卻模糊不清。液晶含量不同意味著膜表面彈性不同，說(shuō)明只有合適的表面彈性才能有助于BMSCs的貼壁黏附和成活，表面彈性過(guò)高則不利于rBM-MSCs的附著生長(zhǎng)。

運(yùn)用溶劑揮發(fā)致相分離方法可成功構(gòu)建聚合物/液晶生物膜。適當(dāng)含量的聚合物/液晶生物膜能支持大鼠骨髓干細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、呈現(xiàn)原有的長(zhǎng)梭狀細(xì)胞形態(tài);但液晶含量過(guò)高則不利于細(xì)胞的附著生長(zhǎng)。

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通訊作者△Tel: 020-85220256; E-mail: zhangjiaqing@ jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31170911) ;澳門科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金(No.064/2013/A2)

［收稿日期］2014-12-12

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1064-06

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.017