姜　霖，吳岳恒，李曉紅，潘　宇，肖　靜，楊翔宇，馮　媛，余細勇△(南方醫(yī)科大學，廣東廣州5055;廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院，廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院風濕免疫科，廣東廣州50080)

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聚乙烯亞胺-蛋白納米復合體轉染蛋白進入骨髓間充質干細胞的應用研究*

姜霖1，2，吳岳恒2，李曉紅2，潘宇2，肖靜2，楊翔宇2，馮媛3，余細勇2△
(1南方醫(yī)科大學，廣東廣州510515;2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院，廣東省心血管病研究所，3廣東省人民醫(yī)院風濕免疫科，廣東廣州510080)

［摘要］目的:探索納米材料聚乙烯亞胺(PEI)攜載不同分子量的蛋白質轉染進人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)的作用及優(yōu)化其最佳配比條件。方法:利用物理化學作用構建6組PEI-DNase I(DNA酶I)復合體，運用激光散射技術初步摸索其最佳摩爾比，用透射電鏡直觀復原納米-蛋白復合體外貌;同時，原代分離培養(yǎng)健康人的骨髓間充質干細胞并進行體外擴增，通過構建成功的4組PEI-GFP(綠色熒光蛋白)納米蛋白復合體對hBMSCs進行轉染，共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，再通過MTT法檢測該復合體對細胞增殖的毒性影響，并用β-半乳糖苷酶實驗驗證其轉入蛋白的活性表現(xiàn)。結果:當PEI與蛋白質的摩爾比為4∶1時，形成的復合體轉染效率最高，β-半乳糖苷酶實驗細胞染色變藍。結論: PEI能與蛋白質形成納米復合體，并能轉染多種蛋白質進入人骨髓間充質干細胞，所轉染的蛋白質分子仍具有活性，為細胞重編程技術提供了新途徑。

［關鍵詞］聚乙烯亞胺;骨髓間充質干細胞;蛋白質轉染

［修回日期］2015-04-23

Proteins are transfected into bone marrow mesenchymal stem cells by polyethyleneimine-protein nano-complexes

JIANG Lin1，2，WU Yue-heng2，LI Xiao-hong2，PAN Yu2，XIAO Jing2，YANG Xiang-yu2，F(xiàn)ENG Yuan3，YU Xi-yong2
(1Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences，3Department of Rheumatology，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China.E-mail: yuxycn@ aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of encapsulated protein transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) by polyethyleneimine (PEI)，and to optimize the best mole ratio of PEI-proteins.METHODS: 6 groups of DNase I-PEI complexes were constructed and the best mole ratio was explored by laser scattering analysis.The appearance of complexes was presented under transmission electron microscope.Meanwhile，4 groups of constructed GFP-PEI complexes were utilized to transfect into the hBMSCs，which were isolated and expand in vitro.The fluorescence intensity of transfected cells was observed under confocal microscope.In addition，the cytotoxicity of the complexes on the cell proliferation was detected by MTT assay.The activity of the intracellular proteins was testified by a β-galactosidase staining experiment.RESULTS: When the mole ratio of PEI and protein was adjusted to 4∶1，the complex transfection efficiency was the best，and β-galactosidase color test turned blue.CONCLUSION: PEI has the character of encapsulating various proteins to nano-complexes.The proteins transfected into bone marrow mesenchymal stem cells are confirmed to have functional activity.As a protein carrier，PEI is of high efficiency and low toxicity，thus providing a new way for stem cell reprogramming.

［KEY WORDS］Polyethyleneimine; Bone marrow mesenchymal stem cells; Protein transfection

蛋白質轉染技術是一門新興的轉染技術，是直接把蛋白質轉入活細胞的過程。目標蛋白質一般要在載體的幫助下，與載體形成復合體而被轉染進入細胞內。蛋白質轉染進入細胞有非常重要的科研價值和應用前景，主要研究有: (1)蛋白質－蛋白質相互作用; (2)細胞內信號傳導、細胞周期調控、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生和轉錄調節(jié); (3)未知蛋白質的功能; (4)干細胞重編程等轉化醫(yī)學領域; (5)功能性轉錄因子的遞送和癌癥治療［1-4］。蛋白質轉染技術的提出，不僅在方法學上促進了該領域及相關領域的發(fā)展，并且拓展了人們對外源性蛋白質分子在哺乳動物細胞中表達與調控的應用。

目前有關蛋白質載體進入細胞研究的報道較少，主要原因之一是基因轉染的普及和成熟，因為將基因轉染進細胞后會翻譯成蛋白質，且已有大量性能穩(wěn)定的基因轉染載體，如病毒、脂質體、納米載體如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)等。其中病毒效率最高，但有不可控風險，脂質體一般認為對細胞毒性較大，而納米載體因為尺寸效應和非病毒性，一般認為比較有潛力成為更安全可靠的基因載體，所以本領域的研究通常集中在對納米載體改性，如在不增加載體細胞毒性的前提下，提高基因轉染的效率［5］。

那么就蛋白質轉染而言，科學家們曾嘗試使用陽離子脂質體、穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)、多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)［6-7］等物質來運載蛋白質進入細胞，但受其轉染效率及細胞毒性的影響，大大限制了它們的應用，而且主要應用的細胞種類較少，基本沒有應用于干細胞領域。目前，基于陽離子的納米載體PEI被認為是最有前途的蛋白載體工具之一，其轉染效率高，分子量易于控制，安全性較佳，結構靈活，易于引入特異性靶向基團對復合體進行修飾從而改善性能。本研究通過構建聚乙烯亞胺－蛋白納米復合體(PEI-protein nano-complexes)，觀察PEI能否轉染不同分子量的蛋白質進入人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)，并考察轉染的蛋白質是否具有活性。

材料和方法

1材料

1.1骨髓來源取自廣東省人民醫(yī)院風濕科20～40歲受試者髂前上棘，術前受試者簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器人骨髓間充質培養(yǎng)基購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司; PEI和β-半乳糖苷酶購自Sigma; DNA上樣緩沖液和DNA marker購自TaKa-Ra; DNase I購自北京康為世紀生物科技有限公司;綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)購自義翹神州生物技術有限公司; Hoechst 33342、PBS購自Life Technologies;β-半乳糖苷酶染色試劑盒套裝購自碧云天生物技術有限公司; MTT細胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司;精密電子天平購自SHIMADZU;激光共聚焦顯微鏡購自Leica;流式細胞儀購自Beckman。

2方法

2.1 hBMSCs的分離、培養(yǎng)及體外擴增采用全骨髓貼壁法，取20～40歲健康人髂前上棘內骨髓3 mL(涂片有骨髓小粒為佳)，混勻后直接加入5 mL復溫后的人骨髓間充質培養(yǎng)基中(10% FBS)，于5% CO2、37℃培養(yǎng)。72 h后，換PBS溶液清洗3次，常規(guī)培養(yǎng)。約7～10 d后，原代細胞貼壁充分，生長融合接近90%后，用0.02% EDTA+ 0.25%胰酶消化成單細胞懸液，1∶3進行傳代。

2.2 hBMSCs的表型鑒定取第3代的hBMSCs消化形成單細胞懸液，用PBS溶液清洗1次，1 200 r/min離心3 min后再用PBS重懸細胞，調整濃度為1×109/L。接著，在收獲的干細胞懸液中分別加入熒光素標記的抗體: FITC-anti human CD45、CD90和CD44; PE-anti human CD29、CD33、CD34、CD105和CD117。混勻后，除CD117于4℃冰箱中孵育30 min，其余皆在室溫下孵育30 min，后1 200 r/min離心3 min，棄去上清，用PBS清洗1次，直接上FACSCalibur流式細胞儀檢測。

2.3 PEI-DNase I復合體和PEI-GFP復合體的構建

PEI－DNase I復合體設為4個處理組，分別加入200 μL 100 mg/L的DNase I溶液，每組再依次加入3.4 μL、1.7 μL、0.9 μL和0.5 μL的PEI溶液的原溶液(8 g/L)，即各組納米粒子與蛋白質的摩爾比依次為16∶1、8∶1、4∶1和2∶1，最后用PBS定容至400 μL，4℃過夜攪拌。

PEI-GFP復合體同樣設為4個處理組，分別加入200 μL 100 mg/L的GFP蛋白溶液和200μL的PBS溶液，接著每組依次加1.6 μL、0.8 μL、0.4 μL和0.2 μL的PEI溶液的原溶液(8 g/L)，即各組納米粒子與蛋白質的摩爾比值依次為16∶1、8∶1、4∶1和2∶1，4℃過夜攪拌。

2.4 PEI-DNase I復合體的激光散射粒徑測試和透射電鏡觀察在激光散射粒徑測試中，單獨PEI對照組為1 g/L的PEI溶液，單獨DNase I對照組為50 mg/L的DNase I溶液，其余4個處理組分別為上述構建的PEI-DNase I復合體(其摩爾比為2∶1、4∶1、8∶1和16∶1)溶液。經過50 Hz水浴超聲20 s后，各取400 μL加入預先潤洗過的激光散射比色皿中，蓋上兩側蓋子，進行測試。

可選擇上述構建的納米-蛋白質復合體中摩爾數(shù)比值為4∶1組，滴加超聲后的復合體液體50 μL于銅網上，干燥后在透射電鏡下觀察復合體形態(tài)。

2.5 PEI-GFP復合體轉染hBMSCs的熒光效果圖及細胞增殖毒性的檢測如上述，構建而成的4組PEI-GFP復合體溶液蛋白原始濃度為50 mg/L，在3 cm confocal小皿中接種第3代的hBMSCs，待細胞長滿至70%左右，則可用含有PEI-GFP復合體(蛋白終濃度為5 mg/L)的培養(yǎng)基進行轉染，即450 μL培養(yǎng)基中分別添加4組50 μL 50 mg/L的PEI-GFP復合體溶液，5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次，每次5 min，接著復染Hoechst 33342 5 min，再用PBS溶液清洗3次，每次5 min，可將活細胞放至激光共聚焦顯微鏡下觀察轉入GFP的熒光表達強弱。

在96孔板里接種hBMSCs 100 μL(約1×104)，置于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;設為7個濃度組:每孔分別加入終濃度為64、32、16、8、4、2 和1 mg/L的PEI-GFP復合體(直接用培養(yǎng)基稀釋，濃度按蛋白濃度計，PEI-GFP摩爾比為4∶1)，繼續(xù)放置于5% CO2、37℃及100%濕度的培養(yǎng)箱中孵育，于第3天時收板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入50 μL 1× MTT溶液，在37℃孵育4 h，使MTT還原為甲臜;后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO使甲臜溶解，用平板搖床搖勻;酶標儀550 nm波長處檢測每孔的吸光度。

2.6 β-半乳糖苷酶實驗檢測PEI復合的蛋白質轉入細胞后的表達活性稱取1 mg的β-半乳糖苷酶粉末，用1 mL PBS溶解，配置成1 g/L的酶溶液，加入5.2 μL的PEI原溶液(8 g/L)，混勻后4℃攪拌30 h，構建PEI-β-半乳糖苷酶復合體。在12孔板中接種第3代的hBMSCs，待細胞長滿至70%左右，用含有PEI-β-半乳糖苷酶復合體(蛋白濃度為50 mg/L)的培養(yǎng)基進行轉染，即1 mL培養(yǎng)基中添加50 μL 1 g/L的PEI-GFP復合體溶液，5% CO2、37℃培養(yǎng)48 h(前6 h不加血清處理，后加10%血清)，后吸除細胞培養(yǎng)基，加入500 μL試劑盒內的細胞固定液，室溫固定10 min，吸去固定液，PBS清洗3次，每次3 min，每孔加入1 mL染色液，37℃孵育過夜，在普通光學顯微鏡下觀察細胞染色情況。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1不同配比下構建的PEI-DNase I復合體的粒徑檢測結果

激光散射粒徑檢測結果顯示，當PEI與DNase I的摩爾比為1∶2和1∶16時，幾乎不能形成復合體的結構;而當PEI與DNase I的摩爾比在1∶4和1∶8時，激光散射強度結果很明顯地顯示溶液相里形成了眾多幾百納米的復合體物質;相較1∶8的配比條件，復合體在1∶4配比下的粒徑更加小(＜500 nm)，且分布更加均勻，見圖1。

Figure 1.The laser scattering diameter test of different mole ratios of PEI-DNase I complexes.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs other guoups.圖1不同摩爾比下PEI-DNase I復合體的激光散射粒徑檢測

2合適摩爾比下PEI-DNase I復合體的透射電鏡結果

由激光散射粒徑檢測可知PEI與DNase I較佳的摩爾配比條件，因此，我們選擇了配比為4∶1時構建的PEI-DNase I復合體做透射電鏡觀察，從大體觀，合成的復合體粒子均勻散布，大部分呈致密的球狀體，而從局部觀，粒子大小較為一致，其直徑大約在200～500 nm，而對照組PEI納米粒子在電鏡下則較難成像，理論上其粒徑大約在0.5～10 nm左右，見圖2。

Figure 2.The appearance of PEI-DNase I complexes in best mole ratio (4∶1) under TEM (×93 000).圖2 PEI與DNase I的摩爾比為4∶1時構建的PEI-DNase I復合體透射電鏡圖

3人骨髓間充質干細胞的表型鑒定

hBMSCs表達CD29、CD33、CD34、CD44、CD45、 CD90、CD105和CD117的百分率分別為(99.11± 0.60) %、(98.70±0.90 ) %、(0.32±0.20 ) %、(97.87±1.40) %、(0.22±0.20) %、(56.20± 11.20) %、(97.32±1.60) %和(0.27±0.10) %。其中，CD29、CD33、CD44和CD105為陽性表達，而CD34、CD45和CD117基本為陰性表達，CD90的表達不穩(wěn)定，浮動較大。CD29和CD44都是骨髓間充質干細胞的公認的標志，CD34則為造血干細胞的主要標志之一，CD45為白細胞的標志物，CD117近來多用于心臟干細胞的表型認證。因此，根據流式細胞檢測得到的結果，可以得出原代分離出的hBMSCs性質較為均一，具有骨髓間充質干細胞的表型特征，見圖3。

Figure 3.Phenotype of hBMSCs detected by flow cytometer.圖3流式細胞術檢測hBMSCs的表面標志

4構建的PEI-GFP蛋白復合體粒子轉染骨髓間充質干細胞

當PEI與GFP配比合適時，PEI能夠以復合體的形式高效攜載GFP蛋白穿膜并在胞內釋放并表達GFP，從而顯示出綠色熒光。當PEI與GFP蛋白的摩爾比為2∶1時，PEI就不足以攜載GFP蛋白而不能形成完整的復合體，因此熒光表達明顯偏低;而PEI與GFP蛋白配比相對較高時，多余的PEI可能會影響二者的自組裝過程，并且PEI表面大量的正電荷可能會影響細胞引起細胞的聚集效應，綜合這些因素，當PEI與GFP蛋白粒子的摩爾比為4∶1時，進入細胞的GFP熒光表達量較多，且通過熒光表達可見PEI-GFP復合體對hBMSCs的轉染效率幾乎為100%，見圖4。

5 MTT法檢測hBMSCs經PEI-GFP復合體轉染后的細胞增殖能力

分別將7組不同濃度的PEI-GFP復合體轉染hBMSCs，3天后利用MTT法對處理的細胞進行增殖毒性的檢測。復合體的轉染對細胞的存活率存在一定的影響，當1 mg/L的復合體轉染hBMSCs時，其存活率大約下降20%，若以此為對照，當轉染的復合體濃度高于4 mg/L時，復合體對細胞的毒性作用就有明顯的統(tǒng)計學意義，隨著復合體轉染濃度的提高，其對hBMSCs增殖的影響也就越來越大，也就意味著毒性作用增大，當高于32 mg/L時，被處理的細胞基本沒有了增殖活性，見圖5。

Figure 4.The fluorescence expression of PEI-GFP complexes constructed by 4 mole ratios after transfected into hBMSCs.圖4 4種摩爾比的PEI-GFP復合體轉染hBMSCs后的熒光表達情況

Figure 5.Detection of cytotoxicity by MTT method on the 3th day.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 1 mg/L.圖5 MTT法檢測不同濃度的PEI-GFP復合體轉染hBMSCs后的細胞增殖毒性

6顯色實驗驗證轉入hBMSCs的β-半乳糖苷酶活性

理論上，β-半乳糖苷酶能夠作用于底物X-Gal從而顯藍色，當PEI-β-半乳糖苷酶復合體轉入hBMSCs后，加入X-Gal以及染色劑孵育，在光鏡下可見細胞內呈現(xiàn)藍色，那么則驗證了被PEI攜載的β-半乳糖苷酶被轉入細胞后能夠正常表達并依然具有活性，見圖6。

討論

隨著納米技術的發(fā)展，科研者們不斷制造出各種具有特殊性能的納米粒載體并用于基因和蛋白質的轉移，包括PLL、PEI、樹枝狀聚合物(dendrimers)、多聚β-氨基酯(PbAE)、脫乙酰殼多糖(chitosan)及明膠等一系列穿膜載體。這類帶正電荷的納米粒子可以通過氫鍵作用、靜電作用、疏水作用甚至范德華力等物理化學作用，很容易地與帶負電荷的基因和蛋白質載體接觸并結合，進而對其展開折疊壓縮等自組裝修飾［8］。早在2005年［9］就有了PEI能對蛋白質進行運輸轉染的報道，逐漸修飾形成致密均勻的納米球狀復合體的研究，而這些復合體在表面效應和體積效應的作用下，會逐漸趨于穩(wěn)定。同時，這也大大開啟了PEI的蛋白轉染之路，目前，已有學者運用硫酸鹽接枝PEI，再通過氧化聚合反應生成的聚合電解質RPC-bPEI來攜載像BSA、溶解酵素等細胞質蛋白，從電解質還原角度來實現(xiàn)蛋白質的傳遞［10］。

眾所周知，蛋白質是主導發(fā)揮生物學作用的終端物質，其復雜而穩(wěn)定的四級結構及其活性基團構象都對細胞、組織乃至生物體的調控產生巨大影響。Bao等［11］使用他們構建的chitosan-PEI-坎替沙坦(CPC)復合體聯(lián)合基因治療來對抗惡性血管腫瘤，這種CPC復合體擁有靶向運送藥物蛋白的功能，CPC和WT-p53基因的聯(lián)合運輸模式更為腫瘤治療提供了一種非常有效的手段，而當PEI與吡啶硫脲發(fā)生自組裝后，會更加有利于運輸具有功能活性的小分子抗體以及抗體抑制劑［12］。鑒于不容小覷的蛋白功能，本實驗室則從蛋白質轉染著手，發(fā)現(xiàn)了只需單純的PEI(1 200 kD)分子，就能夠高效裝載外源性的蛋白質分子通過質膜甚至核膜屏障，并能克服宿主細胞內溶酶體、蛋白酶等對外源蛋白質分子的降解，使其在細胞內發(fā)揮它的活性功能，這無疑開辟了一條基礎過度臨床應用的新道路。

另外，應用于骨髓間充質干細胞的直接轉染一直是科研領域頗為薄弱和單一的技術，hMSCs是具有自我更新和復制能力，并具有多向分化潛能的細胞，其“干性”的維持和細胞本身的特性是轉染技術中亟待克服的兩大硬傷。而目前，hMSCs的轉染實際應用最多的仍舊是病毒型載體，它所轉染的DNA、siRNA、shRNA、microRNA等基因片段過表達或低表達已經廣泛應用于科研領域，但是，卻難以擺脫免疫排斥反應以及病毒介導的隨機整合等潛在危害［13］，Moradian等［14］也曾試過用PEI聯(lián)合碳納米管來轉染eGFP進入MSCs，其最高轉染效率也只達82%，而本實驗PEI轉染GFP蛋白的效率幾乎達到100%。本研究中我們分別構建了PEI-DNase I、PEI-GFP和 PEI-β-半乳糖苷酶3種納米蛋白復合體，發(fā)現(xiàn)無論是低分子量還是高分子量的蛋白質，當PEI和蛋白質微粒的摩爾比是4∶1～8∶1時，構建的復合體對hMSCs的轉染效率最佳。目前，利用納米載體轉染蛋白質分子的研究仍在開發(fā)和探索的過程中，若亞細胞定位的特異性進一步提高后［15］，納米-蛋白轉染技術將具有無可比擬的應用價值和功能優(yōu)勢，臨床應用前景廣闊。

Figure 6.The expression activity of transfected β-galactosidase tested by color reaction experiment.hBMSCs were inoculated in 12 wells with 70% density，transfected by PEI-β-galactosidase complexes(protein concentration is 50 mg/L)，and incubated in 5% CO2at 37℃for 48 h.圖6 β-半乳糖苷酶顯色實驗驗證轉入hBMSCs的β-半乳糖苷酶的表達活性

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通訊作者△Tel: 020-83827812; E-mail: yuxycn@ aliyun.com

*［基金項目］國家自然科學基金重點資助項目(No.81120108003; No.81330007)

［收稿日期］2015-02-26

［文章編號］1000-4718(2015)06-1057-07

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.016