龍允麟，陳　穎，余汝媛，汪　洋(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究院，廣東廣州510632)

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脂多糖持續(xù)刺激巨噬細胞的免疫學(xué)機制初探*

龍允麟，陳穎，余汝媛，汪洋△
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究院，廣東廣州510632)

［摘要］目的:探討巨噬細胞在脂多糖(LPS)的持續(xù)刺激下產(chǎn)生免疫抑制后的表型變化及對T細胞影響的分子機制。方法:蔗糖密度梯度離心法從全血中分離人外周血單個核細胞，結(jié)合磁珠細胞分選技術(shù)分選出單核細胞，體外誘導(dǎo)單核細胞分化為巨噬細胞，以未處理和IFN-γ處理為對照，對LPS處理48 h的巨噬細胞進行形態(tài)學(xué)觀察、細胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表達的檢測和細胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的檢測。同時將LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞與CD3+T細胞進行異體共培養(yǎng)，進一步觀察巨噬細胞對T細胞增殖能力的影響。用實時熒光定量PCR驗證Toll樣受體4(TLR4)信號通路中的非MyD88依賴型途徑相關(guān)分子的表達水平。結(jié)果: LPS處理48 h的巨噬細胞，抗原遞呈能力(HLA-DR)下降，免疫抑制細胞因子IL-10升高，把LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞與異體T細胞共培養(yǎng)6 d，其促進CD8+T細胞增殖的能力較弱。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示LPS持續(xù)刺激下巨噬細胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下調(diào)狀態(tài)。結(jié)論:持續(xù)LPS處理巨噬細胞48 h后，巨噬細胞呈現(xiàn)一種免疫抑制的狀態(tài)，且其刺激CD8+T細胞增殖的能力減弱，這種狀態(tài)與非MyD88依賴型TLR4信號通路受損有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］巨噬細胞;脂多糖;免疫抑制表型; Toll樣受體4

［修回日期］2015-05-04

Immunological mechanism of long-term stimulation by LPS in macrophages

LONG Yun-lin，CHEN Ying，YU Ru-yuan，WANG Yang
(Institutes of Life and Health Engineering，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: 373506762@ qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the molecular mechanism and the immunosuppressive phenotype of macrophages under long-term exposure to lipopolysaccharide (LPS).METHODS: We used Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation combined with MicroBeads Separation Kits to separate peripheral blood mononuclear cells from human blood，and then induced the monocytes into macrophages.We observed the morphology of the macrophages by treating the cells with LPS for 48 h，in comparison with a negative control and IFN-γ treatment.ELISA was used to detect the levels of cytokines，such as IL-10，IL-12，IL-6 and TNF-α，and flow cytometry was used to detect the expression of the surface molecules (HLA-DR，CD14，CCR7，HLA-ABC and CD40).To observe the effect of macrophage on T cell proliferation，co-culture experiment was carried out for 6 d.Real-time PCR was used to validate the expression levels of molecules related to MyD88-independent pathway in Toll-like receptor 4 (TLR4) signal pathway.RESULTS: The antigen-presenting ability of the macrophages was reduced and the IL-10 expression level was increased after the cells were treated with LPS for 48 h.We observed a poor proliferative capacity of CD8+T cells after co-culturing of LPS-induced macrophages with CD3+T cells for 6 d.The results of real-time PCR indicated that TRIF，IRF3 and CIITA were down-regulated in LPS-induced macrophages.CONCLUSION: We successfully established a macrophage model in vitro and observed that LPS-induced macrophages into an immunosuppressive phenotype with poor CD8+T cell proliferative capacity，in which MyD88-independent TLR4 signaling pathway was impaired.

［KEY WORDS］Macrophage; Lipopolysaccharides; Immunosuppressive phenotype; Toll-like receptor 4

巨噬細胞(macrophage，Mφ)由骨髓前體細胞分化而來，作為抗原遞呈細胞，它在固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)均發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。作為一種可塑性極強的調(diào)節(jié)細胞，它參與機體各種功能調(diào)控，如宿主細胞防御調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和免疫功能調(diào)節(jié)等［2-3］。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分。它不僅可在宿主機體抗擊病原體時引發(fā)急性免疫反應(yīng)，還可以幫助建立適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在自然界中，不同細菌的LPS的具體結(jié)構(gòu)和組成有差異，用不同細菌來源的LPS刺激巨噬細胞后，雖然免疫應(yīng)答有差異，但是總體趨勢是一致的。另外，作為Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的配體，LPS既可誘導(dǎo)細胞表面主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex)的表達上調(diào)，又能促進免疫耐受細胞因子(如IL-10)的分泌，并且抑制調(diào)節(jié)型T細胞［4］。

已經(jīng)有報道觀察到生物體在受LPS刺激后，當(dāng)二次刺激時會通過下調(diào)TLR4(Toll-like receptor 4，TLR4)而實現(xiàn)LPS耐受這一現(xiàn)象［5］。TLR4通路是生物體固有免疫系統(tǒng)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的主要受體，其啟動的信號通路還能調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答［6］，它被分為髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴和MyD88非依賴途徑。有報道發(fā)現(xiàn)MyD88缺陷小鼠對LPS刺激幾乎沒有反應(yīng)，說明TLR4-MyD88通路是LPS反應(yīng)所必須的。

在腸道微環(huán)境中，巨噬細胞在外來抗原的持續(xù)刺激下產(chǎn)生的免疫耐受，其分泌及對T細胞的效應(yīng)發(fā)生何種變化且這些變化的分子機理仍需進一步探索。因此，本研究進一步探討人巨噬細胞在LPS持續(xù)刺激下產(chǎn)生免疫抑制后的表型變化及其對T細胞的影響。

材料和方法

1細胞和樣本血液

人血液樣本及相應(yīng)細胞取自廣東省血液中心。

2主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、非必需氨基酸、HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、CFSE細胞增殖檢測試劑盒、Trizol試劑購自Invitrogen; LPS、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、青霉素和鏈霉素購自Sigma;粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)和CD3單克隆抗體(Orthoclone OKT3)購自PeproTech;人白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和人白細胞介素10 (interleukin-10，IL-10)均為BioLegend產(chǎn)品;人白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)購自達科為公司。

人淋巴細胞分離液購自天津川頁生物制品公司;人Monocyte Isolation Kit II和CD3/CD14/CD4 MicroBeads購自美天妮; RT reagent Kit為TaKaRa產(chǎn)品; SsoFast EvaGreen Supermix為Bio-Rad產(chǎn)品; microElute Total RNA Kit購自O(shè)mega。

藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標(biāo)記的人CD163抗體(PE-CD163)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的人CD206抗體(FITC-CD206)、PE-CD14抗體、Alexa488-CD86抗體、PE-CD4抗體、FITC-HLA-DR抗體、PE-CD25抗體和PE-CD69抗體均購自BioLegend。

其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉凱基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

表1　引物序列Table 1.Sequences of the primers

3主要方法

3.1從人的外周血中分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)根據(jù)正常人外周血血紅細胞和白細胞的沉降速度不同，通過自然沉降先把外周血白細胞層分離出來，在有抗凝劑的試管中混勻，37℃靜置60 min，懸液可分3層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，在緊貼紅細胞層上有一呈灰白色的白細胞層，吸出白細胞層，按1∶1的比例用含有1%肝素鈉的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋;再用人淋巴細胞分離液，通過Ficoll-hypaque密度梯度離心法從白細胞層中分離得到單個核細胞，用PBS重懸，細胞計數(shù)，評價單個核細胞的得率。

3.2從單個核細胞中用磁珠分選單核細胞(負選)

將得到的單個核細胞懸液在4℃、300×g離心10 min，去掉上清;每30 μL Running Buffer重懸1×107細胞，加入10 μL FcR Blocking Reagent抗體封閉，加入10 μL Biotin-Antibody Cocktail抗體，4℃均勻孵育10 min;然后加入Running Buffer，再加入20 μL的Anti-Biotin MicroBeads輕柔混勻，4℃均勻孵育15 min;加入1mL Running Buffer稀釋后4℃、300×g離心除去上清;用Running Buffer重懸細胞后加到洗滌好的磁珠柱子中分離，收集穿透液，離心得到單核細胞(monocyte)，用無血清培養(yǎng)基重懸，通過流式檢測分析分選純度。

3.3體外誘導(dǎo)單核細胞分化成巨噬細胞把分選得到的monocyte按1×106cells/well鋪至24孔板，每孔用1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10% Human AB血清，1%雙抗，10 mol/L Hepes，1×非必需氨基酸，1 mol/L丙酮酸鈉，2 mol/L L-谷氨酰胺)，外加20 μg/L的MCSF刺激5 d。培養(yǎng)16 h后，用含0.1% FBS的PBS輕柔地洗滌細胞1次，然后繼續(xù)用新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d(含20 μg/L MCSF)。5 d后，單核細胞分化至巨噬細胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

3.4巨噬細胞與異體淋巴細胞共培養(yǎng)實驗將培養(yǎng)5 d的巨噬細胞加入特定的刺激(LPS/IFN-γ/LPS+ IFN-γ) 48 h后，把富集好的CD3+T細胞按巨噬細胞∶T細胞比例為1∶5的細胞數(shù)量比進行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基為含10%人血清的RPMI-1640，并加入0.1 U/L的IL-2和100 μg/L的OKT3。共培養(yǎng)5 d后，輕柔吸取培養(yǎng)上清，收獲半貼壁的T細胞，流式上機分析。

3.5 CFSE染色細胞增殖檢測，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測及細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的ELISA檢測根據(jù)試劑盒中提供的實驗操作方法進行檢測。

4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，對照組與其它各組比較采用LSD法，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS刺激的巨噬細胞(LPS-Mφ) 48 h后抗原遞呈能力下降

建立巨噬細胞體外誘導(dǎo)模型。首先用PE抗人CD14流式抗體檢測分離得到純度較高的單核細胞，圖1A中單核細胞純度從分離前的13.3%達到分離后的95%，表明單核細胞被成功富集。其次將分離出來的單核細胞經(jīng)過MCSF誘導(dǎo)分化形成巨噬細胞。

為了研究LPS刺激對巨噬細胞的影響，我們選取人類抗原遞呈能力相關(guān)分子HLA-DR、HLAABC［7］及免疫反應(yīng)能力的相關(guān)分子表面抗原CD40、CC類趨化因子受體7(chemokine CC motif receptor 7，CCR7)進行檢測。圖1B和圖1C中LPS-Mφ的HLA-DR表達下調(diào)，表明巨噬細胞經(jīng)過LPS刺激48 h后抗原遞呈能力下降，而作為同樣的炎癥因子IFN-γ-Mφ卻無明顯變化。CD14和CD40分別作為單核細胞及巨噬細胞的標(biāo)志物也未出現(xiàn)明顯變化。巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)在趨化因子CC配體21 (chemokine CC motif ligand 21，CCL21)的招募下能進入淋巴結(jié)與T細胞相互作用受CCR7的依賴［8］。此處LPS-Mφ的CCR7表達下調(diào)，間接表明LPS-Mφ響應(yīng)CCL21的召募參與免疫反應(yīng)的能力減弱。

2 LPS長時間刺激的巨噬細胞無凋亡發(fā)生

為了驗證LPS處理后巨噬細胞的功能減弱不是由于LPS引起巨噬細胞凋亡所致，我們對LPS及IFN-γ處理過的巨噬細胞進行Annexin V-PI凋亡檢測。從圖2可知，由LPS及IFN-γ長時間刺激的巨噬細胞并無凋亡發(fā)生，說明了LPS-Mφ的HLA-DR與CCR7的表達下調(diào)不是由于凋亡所致。

3不同時點LPS-Mφ的細胞表面分子HLA-DR和CCR7的動態(tài)變化

體外誘導(dǎo)單核細胞至巨噬細胞至第5天時，用LPS和IFN-γ分別刺激巨噬細胞0 h～48 h，分別收集0 h、4 h、24 h和48 h時點的巨噬細胞，流式檢測其表面分子的動態(tài)表達情況。如圖3所示，受LPS刺激的巨噬細胞，在0 h～4 h，HLA-DR有所升高，24 h后漸降，表明抗原遞呈能力是一個先升后降的動態(tài)變化。而IFN-γ-Mφ卻是一直上升，CCR7也有與HLA-DR相類似的結(jié)果，說明促炎癥因子IFN-γ能持續(xù)促進巨噬細胞的抗原遞呈能力，而持續(xù)的LPS誘導(dǎo)卻能導(dǎo)致巨噬細胞抗原遞呈能力下降。

4不同時點LPS-Mφ分泌的細胞因子的動態(tài)變化

Figure 1.The continuous stimulation of LPS decreased the antigen-presenting ability of macrophages (Mφ).A: Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation separated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from blood and anti-CD14 MicroBeads Separation Kits was used to enrich the monocytes from PBMC.B: the monocytes were induced into Mφ and then treated with LPS or IFN-γ for 48 h.Antigen presentation-associated markers HLA-ABC，HLA-DR and CCR7 were detected.CD14 and CD40 were used as markers for monocytes and Mφ.C: the mean fluorescent intensity (MFI) of B was measured by flow cytometer.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖1 LPS持續(xù)刺激巨噬細胞后導(dǎo)致抗原遞呈能力下降

巨噬細胞的免疫反應(yīng)都會伴隨細胞因子分泌的變化，為了進一步研究LPS刺激后不同時點巨噬細胞分泌的細胞因子是否有對應(yīng)的變化情況，我們將巨噬細胞用LPS和IFN-γ處理后收集其上清，用ELISA方法檢測不同時點細胞因子IL-10、IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌變化。結(jié)果顯示: LPS-Mφ分泌的IL-10從4 h至24 h一直升高，IFN-γ-Mφ則保持低下，表明48 h的LPS-Mφ是巨噬細胞的一種免疫抑制亞型。LPS-Mφ分泌的IL-1β和TNF-α從4 h至48 h先升后降，IFN-γ-Mφ則一直保持在較低水平，在48 h處上調(diào)。LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ分泌的IL-6的變化規(guī)律與前幾種細胞因子的變化不一樣。以上結(jié)果表明同為促炎癥因子的IFN-γ和LPS對巨噬細胞的刺激后卻有著不同的表型變化及分子機理，短時間的LPS刺激能促進巨噬細胞的免疫反應(yīng)，而持續(xù)刺激卻誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫抑制，見圖4。

Figure 2.The continuous stimulation of LPS and IFN-γ for 24 h did not induce apoptosis of macrophages.圖2巨噬細胞在LPS和IFN-γ刺激24 h后無凋亡發(fā)生

Figure 3.The dynamic changes of HLA-DR and CCR7 of macrophages treated with LPS or IFN-γ from 0 h to 48 h.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖3不同刺激時間LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ的HLA-DR和CCR7的動態(tài)變化

5排除IL-10自分泌引起HLA-DR的高表達

LPS處理后巨噬細胞的IL-10的表達水平持續(xù)升高，表示IL-10可能存在自分泌的形式抑制巨噬細胞的免疫應(yīng)答。為了驗證得到免疫抑制亞型的可靠性，需要排除HLA-DR的表達下調(diào)是來自內(nèi)分泌的IL-10作用。我們利用anti-IL-10R特異性結(jié)合細胞外的IL-10，從而阻止IL-10的自分泌途徑。圖5中，在巨噬細胞的培養(yǎng)基加入不同濃度的IL-10細胞因子，48 h后流式檢測，100 μg/L的IL-10會引起HLADR的表達下調(diào)，用5 mg/L的anti-IL-10R抗體進行封閉，可見HLA-DR表達上升，封閉效果明顯。即使在封閉了IL-10的情況下，LPS-Mφ的HLA-DR下調(diào)且不能恢復(fù)。這結(jié)果說明LPS-Mφ引起HLA-DR低表達并不是由于巨噬細胞自分泌IL-10所引起的，而是由于LPS本身刺激作用所產(chǎn)生的。

6 LPS-Mφ對T細胞增殖的影響

在機體環(huán)境中，巨噬細胞能夠遞呈抗原激活T細胞，而處于免疫抑制的巨噬細胞卻不能實現(xiàn)抗原遞呈［9］。經(jīng)過以上的實驗確實表明LPS的持續(xù)刺激確實能誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生免疫抑制表型，于是我們進一步探索LPS的持續(xù)刺激能否抑制巨噬細胞對T細胞的作用。我們先利用淋巴細胞分離液結(jié)合CD3+T細胞磁珠正選試劑盒，從人外周血分離得到純度較高的CD3+T細胞，再用抗人的CD3流式抗體檢測其純度，可達97%左右，見圖6。

我們以DC作為陽性對照，把不同處理的巨噬細胞和DC分別與CD3+T按1∶5混合培養(yǎng)，6 d后流式細胞儀檢測T細胞的CFSE熒光強度和CD4［T細胞是由CD4陽性的輔助性T細胞(helper T cell，簡稱Th細胞)和CD4陰性、CD8陽性的T殺傷細胞組成］的表達情況，進而觀察LPS處理后的巨噬細胞是否對T細胞有激活效應(yīng)，本實驗通過檢測T細胞的增殖情況來評價其活化程度。如圖6所示，巨噬細胞與CD3+T細胞相互作用都能夠激活并促進其增殖，而LPS-Mφ刺激CD4－/CD8+T細胞增殖為24%，比Medium-Mφ(40%)和IFN-γ-Mφ(50%)少。綜上所述，LPS-Mφ刺激CD8+T細胞的增殖能力較弱。此處DC作為一個陽性對照，旨在更好地說明不同條件下的刺激對T細胞的促增殖情況。

7 LPS持續(xù)刺激導(dǎo)致TLR4信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因表達受損

進一步探索LPS持續(xù)刺激導(dǎo)致巨噬細胞免疫抑制的分子機理，已經(jīng)有文獻表明LPS導(dǎo)致巨噬細胞免疫抑制的原因是通過下調(diào)TLR4通路而實現(xiàn)的，由于TLR4信號通路分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性通路兩種，我們對MyD88非依賴途徑的相關(guān)調(diào)控分子TRIF、IRF3、CIITA和SATA1進行real-time PCR檢測，結(jié)果表明這4個調(diào)控因子的表達均降低。說明LPS持續(xù)刺激巨噬細胞是通過損傷非依賴于MyD88的TLR4信號通路而實現(xiàn)免疫抑制的，見圖7。

Figure 4.The dynamic change of IL-10，IL-6，TNF-α and IL-1β secretion in macrophages treated with LPS or IFN-γ from 0 h to 48 h.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖4不同刺激時間LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ的IL-10、IL-6、TNF-α和IL-1β分泌的動態(tài)變化

Figure 5.LPS decreased HLA-DR expression in macrophages not through IL-10 paracrine pathway.圖5 IL-10受體封閉后LPS刺激巨噬細胞的HLA-DR表達情況以及不同濃度IL-10對巨噬細胞HLA-DR表達的影響

討論

1在對巨噬細胞的刺激中，LPS和IFN-γ的作用效果不同

在免疫系統(tǒng)中，正常巨噬細胞是一種多功能的免疫細胞，在天然免疫中發(fā)揮吞噬病原體和分泌炎性因子的作用，又可以作為抗原遞呈細胞在獲得性免疫中活化T淋巴細胞。巨噬細胞對于炎癥刺激的反應(yīng)一直以來都是研究的熱點，其分子機制也得到很好的闡述。已經(jīng)有報道表明在小鼠腹腔注射LPS之后，第2次注射小鼠機體會產(chǎn)生免疫抑制［9-10］，并且這種抑制是通過下調(diào)TLR4信號通路實現(xiàn)的［5］，本研究在此基礎(chǔ)上進一步探索LPS導(dǎo)致巨噬細胞免疫抑制后對T細胞的影響及其分子機理。我們對巨噬細胞刺激48 h后，LPS-Mφ的HLA-DR降低，IL-10升高，表明抗原遞呈能力減弱，推斷細胞處于一種免疫抑制狀態(tài)。由于LPS-Mφ在48 h分泌的IL-10升高，不可避免地會聯(lián)想到是否由于IL-10的自分泌作用于巨噬細胞，使其HLA-DR表達下降，基于此思考，我們的研究中用IL-10R封閉實驗排除了此點疑慮。另外凋亡實驗也表明LPS導(dǎo)致的HLA-DR的下調(diào)不是由于LPS誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致。

Figure 6.The continuous stimulation of LPS on macrophages decreased the proliferation of CD4－/CD8+T cells in co-culture.A: anti-CD3 MicroBeads Separation Kits was used to enrich the CD3+T cells from PBMC by flow cytometer; B: macrophages were treated with LPS or IFN-γ and co-cultured with CD4－/CD8+T cells for 6 d，then the proliferation of T cells was determined by CFSE assay; C: DC was set as a positive control as compared to macrophages.圖6 LPS刺激后的巨噬細胞對T細胞的增殖影響

2 LPS刺激體現(xiàn)的是先激活后抑制的動態(tài)變化

CCR7是淋巴細胞和DC等遷移進入次級淋巴器官T細胞區(qū)域的主要調(diào)節(jié)者，在這里表達升高間接表明巨噬細胞響應(yīng)趨化因子分泌，一定程度上表明巨噬細胞的活化程度。LPS刺激在0 h、4 h、24 h 和48 h過程中，HLA-DR和CCR7表現(xiàn)為先升后降，在前24 h，巨噬細胞響應(yīng)LPS的刺激，HLA-DR和CCR7升高，但從24 h開始，它們二者開始下降。這種結(jié)果表明，LPS在24 h內(nèi)的刺激會激活巨噬細胞，但超過24 h的刺激后，巨噬細胞逐漸產(chǎn)生一種免疫抑制表型。

3 LPS導(dǎo)致巨噬細胞抗原遞呈能力下降及TLR4信號受阻

LPS-Mφ與CD3+T細胞的混合淋巴細胞培養(yǎng)中，CD4+T細胞的增殖并未受到LPS-Mφ的影響，LPS-Mφ僅對CD8+T細胞的促增殖能力較弱。表明LPS長時間刺激巨噬細胞能夠抑制機體內(nèi)部殺傷性T細胞的增殖，降低機體對病原體的防御。

為了驗證LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞免疫抑制表型的產(chǎn)生機制，有文獻表明LPS是一個經(jīng)典的與TLRs的配體［11］且會引起免疫反應(yīng)，于是我們在RNA水平上驗證了MyD88依賴和非依賴的2條經(jīng)典TLR4的信號通路。此外，MyD88非依賴途徑在腫瘤相關(guān)巨噬細胞缺損中響應(yīng)TLR的研究亦有報道［12］。我們在巨噬細胞中驗證了IFR3/STAT1信號通路，發(fā)現(xiàn)IFR3的表達顯著下降，而且，它們的直接下游調(diào)控蛋白CIITA也顯著下調(diào)，此蛋白直接調(diào)控MHCⅡ類分子的表達［13］。結(jié)合前面的結(jié)果，提示LPS-Mφ的HLA-DR表達下降，有可能激活的是IFR3信號通路的MyD88非依賴途徑。

綜上所述，本研究進一步闡明了持續(xù)的LPS刺激能夠通過阻礙巨噬細胞的TLR4信號通路，從而促使巨噬細胞產(chǎn)生免疫抑制表型，減弱了巨噬細胞對CD8陽性T細胞的活化及促增殖作用。在機體環(huán)境受到外來病原體入侵或者腫瘤發(fā)生時，DC和巨噬細胞都有著抗擊腫瘤、病原體和抗原遞呈的作用，成熟DC已經(jīng)在多種癌癥中被作為細胞免疫治療的疫苗［14-16］，然而，與DC有相同祖先的巨噬細胞，它的抗原遞呈能力和激活T細胞的信號能力卻甚少有人關(guān)注。本研究進一步探索巨噬細胞的免疫應(yīng)答分子機理，為抗炎癥及抗腫瘤藥物研發(fā)提供依據(jù)。

Figure 7.The continuous stimulation of LPS impaired TLR4 pathway in an MyD88-independent manner in macrophages.Macrophages were treated with LPS for 48 h and then the mRNA levels of TRIF，CIITA，IRF3 and MyD88 were detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 4 h;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 24 h.圖7 LPS持續(xù)刺激能損傷非MyD88依賴性的TLR4信號通路

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通訊作者△Tel: 020-85227039; E-mail: 373506762@ qq.com

*［基金項目］國家973項目(No.2011CB910701) ;教育部博士點基金資助項目(No.20104401120008)

［收稿日期］2015-03-10

［文章編號］1000-4718(2015)06-1048-09

［中圖分類號］R392.32

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.015