劉洪濤，周凡涵，申媛媛，張艾潔，賴艷梅，厲紅元(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶400016)

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WNT5B在乳腺癌中的表達(dá)及意義

劉洪濤，周凡涵，申媛媛，張艾潔，賴艷梅，厲紅元△
(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶400016)

［摘要］目的:研究WNT5B在乳腺癌中的表達(dá)，初步探討WNT5B與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法:采用real-time PCR和Western blot法檢測(cè)67例乳腺癌及癌旁組織中WNT5B在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)WNT5B在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)并分析WNT5B的表達(dá)與相關(guān)臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果: 67例乳腺癌組織標(biāo)本中均有不同程度WNT5B的mRNA及蛋白表達(dá)，且WNT5B在乳腺癌組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P＜0.05) ;其中WNT5B在原發(fā)性腫瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表達(dá)明顯高于其在T＞20 mm組患者中的表達(dá)(P＜0.05) ; WNT5B的表達(dá)與乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級(jí)、相關(guān)的免疫組織化學(xué)指標(biāo)(ER、PR、c-ErBb-2、p53和Ki-67)之間無(wú)明顯的相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論: WNT5B在乳腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，WNT5B表達(dá)與乳腺癌患者原發(fā)腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，提示W(wǎng)NT5B可能作為乳腺癌預(yù)后的一個(gè)新的分子標(biāo)志物，為乳腺癌的診治提供新的思路。

［關(guān)鍵詞］WNT5B表達(dá);乳腺癌

［修回日期］2015-04-15

Expression of WNT5B in breast cancer and its clinical significance

LIU Hong-tao，ZHOU Fan-han，SHEN Yuan-yuan，ZHANG Ai-jie，LAI Yan-mei，LI Hong-yuan
(Department of Endocrinology and Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail: hongy_li@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the expression of WNT5B in the breast cancer and further to discuss the correlation between WNT5B and clinicopathologic characteristics of breast cancer.METHODS: The expression of WNT5B at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blot in 67 cases of breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.In addition，the immunohistochemical method was used to detect the expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.The relationships between WNT5B expression and clinicopathologic indexes were also analyzed.RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer was obviously lower than that in the tissue adjacent to carcinoma (P＜0.05).The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in 67 samples of breast cancer was in various degrees.The expression of WNT5B in T≤20 mm group of human breast cancer was obviously higher than that in T＞20 mm group (P＜0.05).The expression of WNT5B had no obvious correlation with axillary lymph node metastasis，histological grade and immunohistochemical indexes of ER，PR，c-ErBb-2，p53 and Ki67 (P＞0.05) in the breast cancer.CONCLUSION: The expression of WNT5B decreases obviously in breast cancer.The expression of WNT5B is related to primary tumor size，which provides new ideas for the diagnosis and treatment of breast cancer，suggesting that WNT5B may be a new molecular marker for prognosis of breast cancer.

［KEY WORDS］WNT5B expression; Breast cancer

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性身心健康的惡性腫瘤之一，近年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，位居女性惡性腫瘤首位［1-2］。目前信號(hào)通路途徑治療惡性腫瘤是生物治療的新興領(lǐng)域，Wnt信號(hào)家族與乳腺癌密切相關(guān)，高達(dá)60%的乳腺癌患者Wnt蛋白過(guò)度表達(dá)［3-4］，在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮關(guān)鍵作用［5-6］。WNT信號(hào)通路功能廣泛、機(jī)制復(fù)雜，WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，以旁分泌或自分泌的方式參與非經(jīng)典WNT通路，參與胚胎發(fā)育時(shí)期細(xì)胞命運(yùn)和組織分化類型的調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生［7-8］。研究顯示，WNT5B在惡性骨肉瘤、肝癌及結(jié)腸癌中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［8-11］，提示W(wǎng)NT5B可能是潛在的腫瘤相關(guān)基因。本研究擬通過(guò)檢測(cè)乳腺癌和乳腺癌旁組織中WNT5B表達(dá)情況并觀察分析其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，旨在初步探討WNT5B與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用，為尋找乳腺癌新的靶點(diǎn)和判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

材料和方法

1標(biāo)本來(lái)源

收集2013年10月～2014年5月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科手術(shù)切除乳腺癌組織及距離癌灶5 cm以上癌旁組織標(biāo)本各67例，年齡30～80歲，平均年齡49歲。經(jīng)術(shù)后病理診斷證實(shí)為乳腺癌，所有患者均為女性且未行術(shù)前放、化療及免疫治療。所有標(biāo)本在離體后30 min內(nèi)立即放入經(jīng)DEPC水處理后的凍存管置于液氮保存，部分標(biāo)本以4%多聚甲醛保存。

2主要試劑和儀器

TRIzol總RNA提取試劑(Invitrogen) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒和DNA Marker (TaKaKa) ; SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑和II抗(北京中杉公司) ;鼠抗人WNT5B單克隆抗體(Santa Cruz) ; real-time PCR儀(ABI) ;自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo) ;凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

3方法

3.1免疫組化(SP法)檢測(cè)WNT5B蛋白的表達(dá)

標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制備免疫組織化學(xué)石蠟切片，免疫組化用SP法檢測(cè)。置67℃恒溫烤箱烘烤2 h后，石蠟切片經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)血清封閉，加鼠抗人WNT5B抗體(滴度1∶100)置4℃孵育過(guò)夜，37℃復(fù)溫后反復(fù)PBS清洗;加生物素標(biāo)記(滴度1∶1 000免疫組化試劑)，37℃孵育15 min;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)鏈霉菌抗生物素蛋白工作液;顯微鏡下控制DAB顯色，清洗后，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠液封片，鏡下觀察結(jié)果。光鏡下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒表示W(wǎng)NT5B免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性，無(wú)棕色顆粒出現(xiàn)為陰性。每張切片由2名病理醫(yī)師在雙盲法下進(jìn)行判定。

3.2 Real-time PCR檢測(cè)WNT5B mRNA的表達(dá)冰凍組織按TRIzol總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)操作。取等量RNA模板加樣，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將按說(shuō)明書(shū)操作完成逆轉(zhuǎn)錄后，得到cDNA第1鏈。以β-actin為內(nèi)參照。WNT5B的上游引物為5’-AAATGCCACGGCGTCTCG-3’，下游引物為5’-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3’，擴(kuò)增片段為163 bp;β-actin的上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物為5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’，擴(kuò)增片段為315 bp。PCR反應(yīng)體系為10 μL體系: SYBR@Premix Ex TaqTM5 μL，上、下游引物各0.1 μL，無(wú)酶水3.8 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min;95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán);65℃延伸15 s。采用2－ΔΔCt法計(jì)算以β-actin表達(dá)量為基準(zhǔn)的WNT5B基因相對(duì)值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

3.3 Western blot檢測(cè)WNT5B蛋白的表達(dá)取勻漿器碾碎組織后加細(xì)胞裂解液、PMSF和Cocktail提取組織總蛋白。酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白濃度，取相同質(zhì)量蛋白加入上樣緩沖液100℃煮沸變性10 min，配置10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，4℃冷庫(kù)內(nèi)100 V 100 min恒壓將蛋白印記電轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)印膜上，5%脫脂奶粉PBST液封閉1 h;鼠抗人WNT5B單克隆抗體(1∶1 000) 4℃冷庫(kù)孵育過(guò)夜;取出PVDF轉(zhuǎn)印膜室溫下PBST反復(fù)清洗3次，每次約10 min;加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室溫孵育40 min; PVDF轉(zhuǎn)印膜室溫下PBST反復(fù)清洗3次，每次約10 min;取化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒中A液和B液等體積混合，加混合液到PVDF膜上暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。暗室膠片曝光。使用Quantity One軟件分析各個(gè)樣本，分別測(cè)量各組中不同基因的灰度值，以β-actin灰度值為基準(zhǔn)，WNT5B/β-actin的相對(duì)值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較行t檢驗(yàn)，3組數(shù)據(jù)間比較行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SP法檢測(cè)WNT5B在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

對(duì)所收集的67對(duì)乳腺癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行組織固定、包埋、切片，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，WNT5B主要位于細(xì)胞胞質(zhì)中。在癌旁組織和乳腺癌組織中WNT5B表達(dá)率分別為78.6%和21.4%。WNT5B蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of WNT5B detected by the method of immunohistochemistry in breast cancer and the tissue adjacent to cancer (×100).圖1 WNT5B在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2 Real-time PCR檢測(cè)WNT5B在乳腺癌組織和癌旁組織中mRNA的表達(dá)水平

WNT5B mRNA在乳腺癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，且癌組織中表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs adjacent group.圖2 WNT5B mRNA在乳腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)

3 Western blot檢測(cè)WNT5B蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

通過(guò)Western blot法檢測(cè)乳腺癌組織和癌旁組織中WNT5B蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示W(wǎng)NT5B蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

4 WNT5B在乳腺癌中表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，WNT5B mRNA及蛋白在乳腺癌中的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同激素受體(EP、PR)狀況、c-ErBb-2、p53、Ki67表達(dá)情況和組織學(xué)分級(jí)間無(wú)顯著差異(P＞0.05) ;在腫瘤大小T≤20 mm組中顯著增高(P＜0.05)，見(jiàn)表1、2。

Figure 3.The protein levels of WNT5B in breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs adjacent group.圖3 WNT5B蛋白在乳腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)

表1　 WNT5B mRNA及蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)之間的關(guān)系Table 1.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with the histological grade of breast cancer (Mean±SD)

討論

WNT5B主要位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，參與胚胎發(fā)育和多種疾病發(fā)生的病理過(guò)程［12-13］，Bradley等［7］研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞中WNT5B通過(guò)抑制JNK信號(hào)的中斷影響軟骨細(xì)胞的增殖與遷移，Kato等［14］在人肺癌A549細(xì)胞和人胰腺癌Panc-1細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，WNT5B參與了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的惡性增長(zhǎng)，提示W(wǎng)NT5B對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過(guò)程起著重要作用，而WNT5B在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中是否具有同樣重要作用尚不清楚;本研究在此基礎(chǔ)上，針對(duì)手術(shù)切除乳腺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本各67例，通過(guò)real-time PCR、免疫組織化學(xué)染色和Western blot法分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)WNT5B在乳腺癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在WNT5B乳腺癌和癌旁組織均有表達(dá)，且癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，提示我們WNT5B在乳腺癌組織中呈低表達(dá)。

進(jìn)一步與臨床病理特征比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)WNT5B表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、EP、PR、Her2、p53、Ki67表達(dá)情況、組織學(xué)分級(jí)之間無(wú)明顯相關(guān)性，而在原發(fā)性腫瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表達(dá)明顯高于其在T＞20 mm組患者中的表達(dá)，即乳腺癌T1期組患者中WNT5B表達(dá)明顯高于T2期和T3期，提示W(wǎng)NT5B與乳腺癌原發(fā)腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，而腫瘤大小與腫瘤的惡性程度和治療效果及預(yù)后生存情況密切相關(guān)，提示乳腺癌組織中低水平表達(dá)的WNT5B可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其具體機(jī)制有待我們進(jìn)一步探索。

綜上所述，WNT5B在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異，與乳腺癌原發(fā)腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)可為乳腺癌的臨床治療方案選擇及預(yù)后判定提供一定的理論依據(jù)，對(duì)乳腺癌的預(yù)防與治療具有重要意義。

表2　 WNT5B mRNA及蛋白表達(dá)與乳腺癌患者相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 2.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with clinicopathologic characteristics of breast cancer (Mean±SD)

［參考文獻(xiàn)］

［1］Roy C，Choudhury KB，Saha A，et al.Metaplastic carcinoma of the breast: a case report with review of literature ［J］.Indian J Cancer，2014，51(3) :381-383.

［2］袁磊，李伯和，時(shí)冉冉，等.沉默JAG1基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(2) : 262-267.

［3］Brennan KR，Brown AM.Wnt proteins in mammary development and cancer［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9(2) :119-131.

［4］Brown AM.Wnt signaling in breast cancer: have we come full circle［J］.Breast Cancer Res，2001，3(6) : 351-355.

［5］李海英，張力，潘歡樂(lè)，等.Wnt信號(hào)通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(9) :1623-1626.

［6］Nusse R.The Wnt gene family in tumorigenesis and in normal development［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1992，43(1-3) : 9-12.

［7］Bradley EW，DrissI MH.WNT5B regulates mesenchymal cell aggregation and chondrocyte differentiation through the planar cell polarity pathway［J］.J Cell physiol，2011，226(6) :1683-1693.

［8］Willert K，Brown JD，Danenberg E，et al.Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors ［J］.Nature.2003，423(6938) :448-452.

［9］Morioka K，Tanikawa C，Ochi K，et al.Orphan receptor tyrosine kinase ROR2 as a potential therapeutic target for osteosarcoma［J］.Cancer Sci，2009，100 (7) : 1227-1233.

［10］Sun D，Qin L，Xu Y，et al.Influence of adriamycin on changes in Nanog，Oct-4，Sox2，ARID1 and Wnt5b expression in liver cancer stem cells［J］.World J Gastroenterol，2014，20(22) :6974-6980.

［11］劉偉，周兵，張紅，等.Wnt-5b在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響［J］.生命科學(xué)研究，2013，17(5) :427-430.

［12］Saitoh T，Katoh M.Molecular cloning and characterization of human WNT5B on chromosome 12p13.3 region［J］.Int J Oncol，2001，19(2) :347-351.

［13］Saitoh T，Katoh M.Expression and regulation of WNT5A and WNT5B in human cancer: up-regulation of WNT5A by TNFα in MKN45 cells and up-regulation of WNT5B by β-estradiol in MCF-7 cells［J］.Int J Mol Med，2002，10 (3) :345-349.

［14］Kato S，Hayakawa Y，Sakurai H，et al.Mesenchymaltransitioned cancer cells instigate theinvasion of epithelial cancer cells through secretion of WNT3 and WNT5B［J］.Cancer Sci，2014，105 (3) :281-289.

通訊作者△Tel: 023-89011496; E-mail: hongy_li@ hotmail.com

［收稿日期］2014-12-15

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1032-04

［中圖分類號(hào)］R730.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.012