靜大鵬，溫曉蕾，李昕穎，李雙民，王秀平，齊慧霞*

(1 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院；3 河北省昌黎縣職業(yè)教育中心)

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不同環(huán)境條件對(duì)釀酒葡萄霜霉病發(fā)病的影響

靜大鵬1，溫曉蕾1，李昕穎2，李雙民3，王秀平1，齊慧霞1*

(1 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院；3 河北省昌黎縣職業(yè)教育中心)

為明確當(dāng)?shù)蒯劸破咸阉共〉陌l(fā)病規(guī)律，以釀酒葡萄品種"赤霞珠"葡萄為材料，采用離體葉片、室內(nèi)、室外人工接種等方法，對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的適宜條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：病菌接種濃度過高和過低均不利于釀酒葡萄霜霉病的發(fā)生，當(dāng)接種濃度為1×108～2×108個(gè)/L最有利于發(fā)?。坏蜏靥幚斫臃N和菌液在葉片上長時(shí)間留存葉片發(fā)病較重；清晨6:00和傍晚18:00接種發(fā)病率最高，室外晴天18:00接種效果最好。

葡萄霜霉??；菌液；低溫處理；病情指數(shù)

葡萄在我國種植廣泛，是河北省秦皇島市昌黎縣主要經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)昌黎也是我國釀酒葡萄種植的主產(chǎn)區(qū)。葡萄霜霉病[Plasmoparaviticola(Berk. et Curtis)Berl. et de Toni]是葡萄生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一[1]，該病病原菌以卵孢子在落葉中或者其他病殘組織中越冬，在冬季溫暖的地區(qū)或年份，可以以菌絲在芽或未脫落的葉片上越冬。第二年在適宜的溫度下，卵孢子在自由水(水滴、水膜、水中)中產(chǎn)生孢子囊，再由孢子囊產(chǎn)生游動(dòng)孢子，借風(fēng)雨傳到寄主葉片上，從葉片背面氣孔侵入，成為春天的最初傳染源，經(jīng)潛育期發(fā)病，再次產(chǎn)生孢子囊進(jìn)行侵染[2，3]。孢子囊萌發(fā)溫度為5～27 ℃，適宜溫度10～15 ℃[4，5]，在適宜霜霉病發(fā)病的年份中，該病菌能不斷產(chǎn)生孢子囊進(jìn)行重復(fù)侵染，對(duì)葡萄的產(chǎn)量造成了巨大的危害。葡萄霜霉病發(fā)病與嚴(yán)重程度和氣候條件密切相關(guān)，低溫高濕的氣候有利于發(fā)病[6，7]。病原菌侵染致病的溫度范圍為11～30 ℃，最適溫度為20～24 ℃[8]，在北方地區(qū)，一般7中旬月開始發(fā)病，8～9月為發(fā)病盛期。本次試驗(yàn)通過設(shè)置不同接種條件，旨在明確其對(duì)釀酒葡萄霜霉病發(fā)病的影響，為當(dāng)?shù)仄咸阉共〉臏y報(bào)及防治提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試菌種：葡萄霜霉病菌于葡萄發(fā)病盛期在秦皇島市昌黎縣種植的赤霞珠上采集得到。

供試葉片：赤霞珠葡萄第3～5節(jié)位上生長的健葉。

1.2 菌液配置

將新鮮葡萄霜霉病病葉置于濕潤的塑料袋中在18～20 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)24 h，至產(chǎn)生大量新生孢子囊后用蒸餾水沖洗葉片，洗下新鮮孢子囊，2層紗布過濾，以5 000 r/min，3 min離心2次，配成孢懸液，并用血球計(jì)數(shù)板測定其濃度，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同接種濃度對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響試驗(yàn) 采用室內(nèi)離體葉片接種法，將未感病新鮮的葉片用蒸餾水沖洗風(fēng)干后備用，隨后將濃度分別為1×106，1×107，1×108，1×109個(gè)/L和2×106，2×107，2×108，2×109個(gè)/L的孢子囊懸浮液用小型噴霧器均勻噴灑到葉片背面，每個(gè)濃度分別接種3片葉，每片葉噴菌液約2 mL，以液珠不從葉片表面落下為宜[8]，試驗(yàn)3次重復(fù)。接種后放入16～18 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將溫度調(diào)到20～24 ℃，觀察其初侵染期并繼續(xù)培養(yǎng)于7 d后調(diào)查病情，并計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

病情調(diào)查采用6級(jí)記載法[9]，根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分率劃分病級(jí)：

0 級(jí)，無病斑；

1 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的5% 以下；

3 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～25% ；

5 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的26%～50%；

7 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的51%～75%；

9 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的75%以上。

病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病葉盤數(shù)×該級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~盤數(shù)×發(fā)病最高級(jí)代表值)]×100%

1.3.2 菌液留存時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響試驗(yàn) 用打孔器將未感病嫩葉打成直徑為1.5 cm小圓葉片，用移液槍在葉盤中心點(diǎn)接30 μL孢子懸浮液，使菌液分別在葡萄葉片上存留0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h 后吸凈菌液，放入15 ℃下晝夜光照交替的人工氣候培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，每個(gè)處理20片圓葉片，3次重復(fù)。觀察記載潛育期并于7 d后調(diào)查病情，并計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法同1.3.1。

1.3.3 低溫處理對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響試驗(yàn) 采用離體葉片接種，選擇健康的葡萄植株的第3～5節(jié)位葉片，用蒸餾水沖洗后風(fēng)干，葉背朝上放入直徑15 cm并鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，將配置好的1×108～2×108個(gè)/L孢子囊懸浮液在15 ℃的低溫處理30 min后，用小型噴霧器將菌懸液均勻噴灑到葉背，使藥液分布均勻，以液珠不從葉片表面落下為宜[8]，以室溫下未做處理的菌液直接接種作為對(duì)照。每一處理選取4片健康無病的葉片進(jìn)行接種，3次重復(fù)，接種后置于20～24 ℃條件下培養(yǎng)，并保持濾紙濕潤，保證葉片不失活力。觀察記載潛育期，9 d后調(diào)查病情，并計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法同1.3.1。

1.3.4 不同接種時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每一處理選取20個(gè)3～5節(jié)位葉片，共設(shè)置15個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列，小區(qū)面積為26.62 m2(6.12 m×4.35 m)。將配置好的1×108～2×108個(gè)/L孢懸液，用喉頭噴霧器分別于晴天和陰天的6:00，10:00，12:00，14:00，18:00在田間進(jìn)行接種，9 d后調(diào)查病情，并計(jì)算病情指數(shù)。病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法同1.3.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2003版和DPS 7.05版分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用字母標(biāo)記法進(jìn)行Duncan’s新復(fù)級(jí)差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種濃度對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

孢子囊懸浮液濃度在1×107～1×109個(gè)/L時(shí)，健葉的發(fā)病時(shí)間最早為接種后第3天，并且孢子懸浮液濃度在1×108個(gè)/L時(shí)病情指數(shù)最高，為72.84(表1)；孢子懸液濃度在2×106～2×109個(gè)/L時(shí)，其發(fā)病都在接種后第4天，并且當(dāng)濃度為2×108個(gè)/L時(shí)，病情指數(shù)最高，為80.25，且與其他濃度差異均明顯，但與1×108個(gè)/L濃度差異不明顯；接種濃度在1×106～2×106個(gè)/L和1×107～2×107個(gè)/L時(shí)病情指數(shù)均不高。由此可見，孢子懸浮液的濃過高或者過低都會(huì)對(duì)發(fā)病產(chǎn)生影響，當(dāng)濃度為1×108～2×108個(gè)/L時(shí)，潛育期較短且病情指數(shù)最高，可做為室內(nèi)離體葉片接種的參考濃度。

2.2 菌液存留時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

菌液存留時(shí)間對(duì)接種葉片所造成的葡萄霜霉病病情指數(shù)由高到低依次為：4.5 h，4.0 h，3.5 h，3.0 h，2.5 h，2.0 h，1.5 h，1.0 h，0.5 h，0 h(表2)；菌液在葉片留存4.5 h和4.0 h病情指數(shù)較大，并且與其他處理相比差異顯著；霜霉病潛育期隨菌液在葡萄葉片上留存的時(shí)間延長而縮短，接種后立即將菌液吸干所需要發(fā)病時(shí)間為6 d，而菌液留存4.0～4.5 h后再將其吸干葉片發(fā)病所需要時(shí)間則僅需3 d。由此可見，菌液在葉片上留存時(shí)間越長，葡萄霜霉病發(fā)病就越早、越嚴(yán)重。

表1 不同接種濃度對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

注：數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)的病情指數(shù)“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn) 誤”；同列進(jìn)行Duncan's新復(fù)級(jí)差法分析， 大寫字母代表0.01水平的差異情況，小寫 字母代表0.05水平的差異情況。下同。

表2 菌液存留時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

2.3 低溫處理對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

低溫處理葡萄霜霉病菌30 min后接種，潛育期為4 d，而未經(jīng)低溫處理的潛育期為5 d(表3)。低溫處理后的病情指數(shù)高于常溫直接接菌且差異顯著。結(jié)合圖1可以也看出，低溫處理后的葉片上霜霉菌絲生長較為密集，連接成白色霉層，面積較大，與表3中的病情指數(shù)相一致。由此說明菌液經(jīng)過低溫處理后可加速霜霉病的發(fā)病，且后期發(fā)病比對(duì)照較為嚴(yán)重。

表3 低溫處理對(duì)葡萄霜霉病潛育期及發(fā)病的影響

圖1 葡萄霜霉病菌低溫處理與常溫直接接菌后在葉片的發(fā)病情況

2.4 不同接種時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病的影響

陰天時(shí)田間接種后的霜霉病的發(fā)病率均高于晴天接種的發(fā)病率，且10：00～14：00接種后的發(fā)病率均低于早上6：00和傍晚18：00接種的(圖2)。上午6：00接種，晴天和陰天的效果相差不大，但隨著接種時(shí)間推移，晴天情況下氣溫急劇上升，其接種后的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陰天的發(fā)病率，這也說明了溫度對(duì)霜霉菌侵染有一定的影響。

除晴天18：00接種外，其他各個(gè)時(shí)間段無論是晴天或者陰天，接種后的病情指數(shù)均在15以下，并且各處理差異均不明顯(圖3)。在所有處理中晴天18:00接種后病情指數(shù)最高，病情指數(shù)為26.35，且與其他處理差異顯著。綜上所述，晴天18:00接種所達(dá)到的病情指數(shù)最高，效果最好。

圖2 不同接種時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病發(fā)病率的影響 圖3 不同接種時(shí)間對(duì)葡萄霜霉病病情指數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，室內(nèi)離體葉片接種濃度過高和過低都會(huì)影響葡萄霜霉病的快速發(fā)病，當(dāng)接種濃度為1×108～2×108個(gè)/L時(shí)較為適中，其潛育期較短且病情指數(shù)最高。

葡萄霜霉病菌孢子囊萌發(fā)對(duì)環(huán)境要求較嚴(yán)格。常永義等[10]研究表明，病菌孢子囊只有在水膜中才能萌發(fā)，而后從葉片背面氣孔侵入。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，菌液在葉片上留存4.0～4.5 h后再將其吸干，葉片發(fā)病所需要時(shí)間則僅需3 d，并且病情指數(shù)較大。從而可見，菌液在葉片上留存時(shí)間越長，越有利于病菌孢子囊在水中的萌發(fā)，進(jìn)而影響霜霉病的發(fā)病情況。

葡萄霜霉病屬于低溫病害，病菌孢子囊的形成、萌發(fā)以及游動(dòng)孢子的萌發(fā)侵入均要求一定的溫濕度條件，低溫會(huì)縮短孢子囊的休眠期[11，12]，從而促使孢子囊釋放出更多的游動(dòng)孢子進(jìn)行侵染。郭小俠等[13]研究認(rèn)為，葡萄霜霉病原菌侵染致病的溫度范圍為11～30 ℃，最適溫度為20～24 ℃。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度在20～24 ℃下也適宜釀酒葡萄霜霉病病害的發(fā)生，但低溫處理菌液后能夠提升菌液活性，從而更有利于葉片發(fā)病，而且后期發(fā)病較重。

郭明浩[15]研究表明，葡萄霜霉病的卵孢子的死亡率與溫度呈極顯著相關(guān)，原因是隨氣溫上升，造成周邊環(huán)境干燥條件，土壤微生物的抑制等因素造成卵孢子死亡，并且降雨可以間接地影響相對(duì)濕度，從而影響卵孢子的萌動(dòng)和侵染。在本次研究的釀酒葡萄霜霉病室外接種試驗(yàn)中，陰天接種的發(fā)病率高于晴天接種的，清晨6：00和傍晚18：00接種的發(fā)病率高于其他時(shí)間接種的發(fā)病率，晴天傍晚18：00接種病情指數(shù)相較陰天18：00接種的病情指數(shù)也高，也恰恰說明了早晚上的低溫高濕條件利于孢子囊釋放大量游動(dòng)孢子，為病菌的侵染提供了有力條件，從而引起病害的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Effect of Different Environmental Conditions on Occurrence of Wine Grape Downy Mildew

JING Da-peng1，WEN Xiao-lei1，LI Xin-ying2，LI Shuang-min3，WANG Xiu-ping1，QI Hui-xia1

(1 College of Life Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei,066600; 2 College of Agricultrue and Forestry Science and Technology,Hebei North University; 3 Vocational Education Center of Changli County;China)

In order to clarify the law of local wine grape downy mildew with the grape varieties cabernet sauvignon as test material, the suitable conditions for the occurrence of grape downy mildew were studied by using the methods of leaf, indoor and outdoor artificial inoculation, in order to make clear the occurrence regularity of local wine grape downy mildew and provide certain theoretical guidance for the measurement and control. The results showed that neither high or low inoculation concentration is conducive to the occurrence of downy mildew, the concentration of 1×108～2×108cells/L is the most conducive onset; Low temperature inoculation and overtime bacteria retained on the blade make the leaves onset. 6：00 am. and 18：00 pm. Is the highest incidence and vaccination period, inoculation at 18：00 pm in a sunny day will be the best.

grape downy mildew; bacterial liquid; low temperature treatment; disease index

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：C2014407061)。

2015-10-13; 修改稿收到日期: 2015-12-04

10． 3969 /J． ISSN． 1672-7983． 2015． 04． 008

S436.631.1

A

1672-7983(2015)04-0036-05

靜大鵬(1990-)，男，碩士研究生。主要研究方向：葡萄霜霉病的發(fā)生與防治。

*通訊作者，女，碩士，教授。主要研究方向：植物病害流行及防治。E-mail: qihuix@163.com。