王 欣，王 琦，齊曉雪， 畢 瑩， 倪宏波

( 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院， 黑龍江大慶 163319)

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傳染性鼻氣管炎病毒gD基因表位的原核表達與純化

王 欣，王 琦，齊曉雪， 畢 瑩， 倪宏波*

( 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院， 黑龍江大慶 163319)

[目的] 對牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)gD基因表位進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行純化鑒定。[方法] 利用PCR擴增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，并構建原核表達重組質粒pET-28a-gD。將其轉入BL21(DE3)表達菌中，IPTG誘導表達。表達的gD重組蛋白經(jīng)親和層析純化后，進行Western blot分析。[結果] 重組表達質粒pET-28a-gD經(jīng)PCR、雙酶切及測序證明構建正確。SDS-PAGE表明，gD蛋白在大腸埃希菌中高效表達，表達的重組蛋白相對分子量約48 ku，與預期的蛋白分子量一致。純化后的gD重組蛋白濃度為0.128 mg/ml，免疫印跡結果顯示純化后的gD重組蛋白能與IBR標準陽性血清發(fā)生特異性反應，說明其免疫原性良好。[結論] 成功表達了gD基因表位蛋白，該蛋白具有良好的反應原性，可作為預防IBR基因工程亞單位疫苗的候選抗原。

IBR；gD；表達；純化；亞單位疫苗

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)可引起牛發(fā)生急性、熱性、接觸性傳染病——牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)[1]，主要表現(xiàn)為呼吸道和生殖道感染[2-3]。IBRV 主要基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因[4]，其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面，能誘導機體產(chǎn)生保護性抗體[5]，因此gD可作為鑒別診斷IBR的首選特異性抗原[6]。筆者通過大腸桿菌表達IBRV 的gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，為后續(xù)診斷方法的建立和亞單位疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和質粒

牛腎細胞(MDBK)、IBRV分離株、原核表達載體pET-28a(+)、DH 5α菌種、BL21 (DE3)菌種均由黑龍江八一農(nóng)墾大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 血清與抗體

牛傳染性鼻氣管炎的標準陰、陽性血清均購自中國獸藥監(jiān)察所；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗牛IgG購自Sigma公司。

1.3 主要試劑和酶

Trizol Reagent、蛋白純化試劑購自Invitrogen公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自四季青生物工程材料有限公司(杭州)；NheI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA快速提取劑盒與質粒提取試劑盒均購自北京博凌科為生物科技有限公司；膠回收試劑盒購自西諾遠大科技有限公司(北京)；低分子質量蛋白質Marker和預染低分子質量蛋白質Marker均購自賽默飛世爾(Thermo Scientific)科技有限公司。

1.4 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的BHV-1 gD蛋白的基因序列，利用DNAStar和Prime 5.0設計3對引物，并在引物的 5′端加入相應的酶切位點和保護性堿基，用于擴增gD基因的3個抗原表位，由試劑公司進行合成。

表1 PCR反應的引物和產(chǎn)物大小

1.5 PCR 擴增及基因克隆

采用上述特異性引物對gD-A、gD-B和gD-C分別進行PCR擴增，PCR反應體系為現(xiàn)有技術中常規(guī)反應體系。gD基因擴增反應條件：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min,35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，紫外燈下切割目的條帶，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.6 重組表達質粒構建

用NheI和HindⅢ雙酶切重組質粒pMD-gD和原核表達載體pET-28a(+)，連接后轉化BL21(DE3)感受態(tài)，通過PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進行篩選和鑒定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 重組蛋白的誘導表達

將陽性克隆質粒轉化進入BL21(DE3)感受態(tài)中，獲得重組陽性菌，用于蛋白表達，挑取單個陽性菌落接種在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。待OD600達到0.6 時，加入 IPTG至終濃度為0.2 mmol/L進行誘導。同時設置表達載體對照組，誘導表達后4 h取菌液，12 000 r/min 離心1 min，保存沉淀。PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解后，10 000 r/min 離心20 min，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，鑒定目的蛋白是否表達和表達方式。

1.8 表達產(chǎn)物的純化和濃度測定

將表達的重組菌液4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，棄上清，沉淀用PBS洗2次后，用10%菌液體積的PBS重懸，在冰水混合物中冷卻60 min后進行超聲破碎(Plus on：5 s，Plus off：15 s)，直到菌液變?yōu)榍辶粒? ℃ 10 000 r/min 離心20 min，收集沉淀。沉淀用8 mol/L尿素(菌液體積的5%)在冰上重懸沉淀，用移液器反復吹吸，直到完全溶解，4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，除去不溶成分后，加入平衡好的層析柱內(nèi)，在低溫低速振蕩器上作用1 h后，垂直放好層析柱，讓樹脂在重力作用下自然下沉，打開層析柱底端蓋帽，讓液體逐滴滴下并收集好，在接近液體與層析柱交界面處，關閉層析柱底端蓋帽。向層析柱內(nèi)加入8 ml Denaturing Wash BufferA和B分別重復洗滌3～4次并收集洗滌液，最后用20 ml Denaturing Elution Buffer對層析柱進行徹底洗脫，收集洗脫液及目的蛋白，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.9 Western Blot 鑒定

將純化后的gD蛋白樣品處理后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，切去跑完后膠條的多余部分，經(jīng)電轉印至NC膜上，用5%的脫脂奶粉在37 ℃水平搖床上封閉2 h；用5%的脫脂奶粉對一抗所用的IBR標準陽性血清按1∶300倍進行稀釋，37 ℃水平搖床上作用1 h；酶標二抗兔抗牛IgG用5%的脫脂奶粉以1∶5 000倍稀釋，37 ℃水平搖床上作用1 h；用DAB顯色觀察結果。

2 結果與分析

2.1 gD基因的PCR擴增結果

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在約423、267、57 bp處可見明顯的基因片段，與試驗的預期大小相符(圖1)。

2.2 重組原核表達質粒的雙酶切鑒定

構建的pET-28a-gD重組表達載體經(jīng)NheI/HindⅢ 雙酶切可以切出約747 bp的目的片段(圖2)。

2.3 gD重組蛋白的SDS-PAGE檢測

將誘導的重組菌和空載體進行SDS-PAGE檢測，結果顯示誘導的重組菌有特異性條帶，分子量為48 ku，與預期的蛋白分子量相符，而誘導的空載體卻沒有該特異性條帶，且主要以包涵體的形式表達(圖3)。

2.4 gD重組蛋白的純化

將包涵體蛋白和可溶性蛋白過Ni柱純化后，目的條帶明顯。蛋白濃度按照BCA法測定，純化后的gD重組蛋白濃度為0.128 mg/ml(圖4)。

2.5 gD重組蛋白的Western blot檢測

將純化后的gD蛋白轉印到NC膜上，進行Western blot 分析檢測，結果顯示，表達的融合蛋白在48 ku位置出現(xiàn)陽性條帶，且所表達的蛋白具有良好的免疫學活性，判定所表達的蛋白為gD融合蛋白(圖5)。

3 結論與討論

利用分子生物學軟件對gD全基因及其編碼的氨基酸進行分析，通過分析目的基因的酶切位點和預測目的蛋白的跨膜區(qū)、信號肽序列及抗原表位等分子生物學特性，在參考相關文獻的基礎上[7]，選取抗原決定簇較集中且具有良好抗原性和親水性的序列基因，在gD基因上隨機選取3段線性表位，應用引物設計軟件，設計出3對特異性引物，成功擴增出3段目的片段。目的蛋白成功表達后，經(jīng)超聲破碎裂解，用親和層析柱對其進行純化和濃縮，SDS-PAGE結果顯示，目的蛋白的純度較高，成功擴增出IBR gD部分抗原表位基因，并將其定向克隆到原核表達載體上，并成功表達，經(jīng)親和層析柱純化后，得到了具有良好抗原性且純度較高的gD融合蛋白，且Western blot檢測結果顯示，重組的融合蛋白與IBR標準陽性血清能夠發(fā)生特異性反應，說明得到的重組蛋白具有良好的抗原性，能夠作為IBRV檢測的優(yōu)勢抗原使用[8]，為牛傳染性鼻氣管炎的檢測和防疫提供了便利條件，同時也為針對該病的診斷試劑盒的研制提供物質基礎。

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[5] BLANC A M,BEROIS M B,TOMé L M,et al.Induction of humoral responses to BHV-1 glycoprotein D expressed by HSV-1 amplicon vectors[J].J Vet Sci,2012,13(1):59-65.

[6] BLANC A M,BEROIS M B,TOMé L M,et al.Induction of humoral responses to BHV-1 glycoprotein D expressed by HSV-1 amplicon vectors[J].J Vet Sci,2012,13(1):59-65.

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Expression and Purification of Gene gD of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

WANG Xin, WANG Qi, QI Xiao-xue, NI Hong-bo*et al

(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163319)

[Objective ]To construct a fusion gene of EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC) adhesion K99,987P and F41,and purify the fusion expressed protein.[Method]A pair of primers was designed according to the IBRV gD sequences in GenBank to amplify the complete open reading frame.PCR product of gD,containing three epitope: gD-A,gD-B,gD-C,was then inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-gD respectively,then transform the recombinant plasmid into competent cells of BL21 (DE3).After induced by IPTG, the expressed recombinant protein gD was purified by nickel ion affinity chromatography and analyzed by Western blot.[Result]The recombinant plasmid was confirmed by PCR,restriction analysis and sequencing.The expressed recombinant protein with a relative molecular mass of about 48 ku.The concentration of the purified recombinant protein was 0.128 mg/ml for gD.The fusion protein specifically reacted with IBRV polyclonal antibody from mice,indicating good reactionogenicity.[Conclusion] Recombinant plasmid pET-28a-gD is constructed and expressed inE.coliBL21(DE3),indicating that protein gD is potential of candidate antigen for prevention of IBR.

IBRV; gD; Expr

黑龍江省農(nóng)墾總局攻關項目(HNK125B-11-02；HNK125B-11-10A)。

王欣(1972- )，女，遼寧蓋州人，講師，碩士，從事食品微生物學研究。*通訊作者，教授，博士，從事分子病原學與免疫學研究。

2015-11-11

S 858.23

A

0517-6611(2015)35-231-03