王 欣，王 琦，齊曉雪， 畢 瑩， 倪宏波

( 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院， 黑龍江大慶 163319)

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傳染性鼻氣管炎病毒gD基因表位的原核表達(dá)與純化

王 欣，王 琦，齊曉雪， 畢 瑩， 倪宏波*

( 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院， 黑龍江大慶 163319)

[目的] 對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)gD基因表位進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定。[方法] 利用PCR擴(kuò)增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，并構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-gD。將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的gD重組蛋白經(jīng)親和層析純化后，進(jìn)行Western blot分析。[結(jié)果] 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-gD經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序證明構(gòu)建正確。SDS-PAGE表明，gD蛋白在大腸埃希菌中高效表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子量約48 ku，與預(yù)期的蛋白分子量一致。純化后的gD重組蛋白濃度為0.128 mg/ml，免疫印跡結(jié)果顯示純化后的gD重組蛋白能與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明其免疫原性良好。[結(jié)論] 成功表達(dá)了gD基因表位蛋白，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為預(yù)防IBR基因工程亞單位疫苗的候選抗原。

IBR；gD；表達(dá)；純化；亞單位疫苗

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)可引起牛發(fā)生急性、熱性、接觸性傳染病——牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)[1]，主要表現(xiàn)為呼吸道和生殖道感染[2-3]。IBRV 主要基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因[4]，其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[5]，因此gD可作為鑒別診斷IBR的首選特異性抗原[6]。筆者通過(guò)大腸桿菌表達(dá)IBRV 的gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，為后續(xù)診斷方法的建立和亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒

牛腎細(xì)胞(MDBK)、IBRV分離株、原核表達(dá)載體pET-28a(+)、DH 5α菌種、BL21 (DE3)菌種均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 血清與抗體

牛傳染性鼻氣管炎的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗牛IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.3 主要試劑和酶

Trizol Reagent、蛋白純化試劑購(gòu)自Invitrogen公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自四季青生物工程材料有限公司(杭州)；NheI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA快速提取劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自西諾遠(yuǎn)大科技有限公司(北京)；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和預(yù)染低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自賽默飛世爾(Thermo Scientific)科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的BHV-1 gD蛋白的基因序列，利用DNAStar和Prime 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物，并在引物的 5′端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，用于擴(kuò)增gD基因的3個(gè)抗原表位，由試劑公司進(jìn)行合成。

表1 PCR反應(yīng)的引物和產(chǎn)物大小

1.5 PCR 擴(kuò)增及基因克隆

采用上述特異性引物對(duì)gD-A、gD-B和gD-C分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)反應(yīng)體系。gD基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min,35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，紫外燈下切割目的條帶，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

用NheI和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-gD和原核表達(dá)載體pET-28a(+)，連接后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，通過(guò)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行篩選和鑒定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)中，獲得重組陽(yáng)性菌，用于蛋白表達(dá)，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落接種在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。待OD600達(dá)到0.6 時(shí)，加入 IPTG至終濃度為0.2 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。同時(shí)設(shè)置表達(dá)載體對(duì)照組，誘導(dǎo)表達(dá)后4 h取菌液，12 000 r/min 離心1 min，保存沉淀。PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解后，10 000 r/min 離心20 min，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定目的蛋白是否表達(dá)和表達(dá)方式。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的純化和濃度測(cè)定

將表達(dá)的重組菌液4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，棄上清，沉淀用PBS洗2次后，用10%菌液體積的PBS重懸，在冰水混合物中冷卻60 min后進(jìn)行超聲破碎(Plus on：5 s，Plus off：15 s)，直到菌液變?yōu)榍辶粒? ℃ 10 000 r/min 離心20 min，收集沉淀。沉淀用8 mol/L尿素(菌液體積的5%)在冰上重懸沉淀，用移液器反復(fù)吹吸，直到完全溶解，4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，除去不溶成分后，加入平衡好的層析柱內(nèi)，在低溫低速振蕩器上作用1 h后，垂直放好層析柱，讓樹(shù)脂在重力作用下自然下沉，打開(kāi)層析柱底端蓋帽，讓液體逐滴滴下并收集好，在接近液體與層析柱交界面處，關(guān)閉層析柱底端蓋帽。向?qū)游鲋鶅?nèi)加入8 ml Denaturing Wash BufferA和B分別重復(fù)洗滌3～4次并收集洗滌液，最后用20 ml Denaturing Elution Buffer對(duì)層析柱進(jìn)行徹底洗脫，收集洗脫液及目的蛋白，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.9 Western Blot 鑒定

將純化后的gD蛋白樣品處理后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切去跑完后膠條的多余部分，經(jīng)電轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%的脫脂奶粉在37 ℃水平搖床上封閉2 h；用5%的脫脂奶粉對(duì)一抗所用的IBR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按1∶300倍進(jìn)行稀釋，37 ℃水平搖床上作用1 h；酶標(biāo)二抗兔抗牛IgG用5%的脫脂奶粉以1∶5 000倍稀釋，37 ℃水平搖床上作用1 h；用DAB顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 gD基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在約423、267、57 bp處可見(jiàn)明顯的基因片段，與試驗(yàn)的預(yù)期大小相符(圖1)。

2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

構(gòu)建的pET-28a-gD重組表達(dá)載體經(jīng)NheI/HindⅢ 雙酶切可以切出約747 bp的目的片段(圖2)。

2.3 gD重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

將誘導(dǎo)的重組菌和空載體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)的重組菌有特異性條帶，分子量為48 ku，與預(yù)期的蛋白分子量相符，而誘導(dǎo)的空載體卻沒(méi)有該特異性條帶，且主要以包涵體的形式表達(dá)(圖3)。

2.4 gD重組蛋白的純化

將包涵體蛋白和可溶性蛋白過(guò)Ni柱純化后，目的條帶明顯。蛋白濃度按照BCA法測(cè)定，純化后的gD重組蛋白濃度為0.128 mg/ml(圖4)。

2.5 gD重組蛋白的Western blot檢測(cè)

將純化后的gD蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，進(jìn)行Western blot 分析檢測(cè)，結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白在48 ku位置出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，且所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，判定所表達(dá)的蛋白為gD融合蛋白(圖5)。

3 結(jié)論與討論

利用分子生物學(xué)軟件對(duì)gD全基因及其編碼的氨基酸進(jìn)行分析，通過(guò)分析目的基因的酶切位點(diǎn)和預(yù)測(cè)目的蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽序列及抗原表位等分子生物學(xué)特性，在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[7]，選取抗原決定簇較集中且具有良好抗原性和親水性的序列基因，在gD基因上隨機(jī)選取3段線性表位，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性引物，成功擴(kuò)增出3段目的片段。目的蛋白成功表達(dá)后，經(jīng)超聲破碎裂解，用親和層析柱對(duì)其進(jìn)行純化和濃縮，SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的蛋白的純度較高，成功擴(kuò)增出IBR gD部分抗原表位基因，并將其定向克隆到原核表達(dá)載體上，并成功表達(dá)，經(jīng)親和層析柱純化后，得到了具有良好抗原性且純度較高的gD融合蛋白，且Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，重組的融合蛋白與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清能夠發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明得到的重組蛋白具有良好的抗原性，能夠作為IBRV檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)抗原使用[8]，為牛傳染性鼻氣管炎的檢測(cè)和防疫提供了便利條件，同時(shí)也為針對(duì)該病的診斷試劑盒的研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Expression and Purification of Gene gD of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

WANG Xin, WANG Qi, QI Xiao-xue, NI Hong-bo*et al

(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163319)

[Objective ]To construct a fusion gene of EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC) adhesion K99,987P and F41,and purify the fusion expressed protein.[Method]A pair of primers was designed according to the IBRV gD sequences in GenBank to amplify the complete open reading frame.PCR product of gD,containing three epitope: gD-A,gD-B,gD-C,was then inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-gD respectively,then transform the recombinant plasmid into competent cells of BL21 (DE3).After induced by IPTG, the expressed recombinant protein gD was purified by nickel ion affinity chromatography and analyzed by Western blot.[Result]The recombinant plasmid was confirmed by PCR,restriction analysis and sequencing.The expressed recombinant protein with a relative molecular mass of about 48 ku.The concentration of the purified recombinant protein was 0.128 mg/ml for gD.The fusion protein specifically reacted with IBRV polyclonal antibody from mice,indicating good reactionogenicity.[Conclusion] Recombinant plasmid pET-28a-gD is constructed and expressed inE.coliBL21(DE3),indicating that protein gD is potential of candidate antigen for prevention of IBR.

IBRV; gD; Expr

黑龍江省農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目(HNK125B-11-02；HNK125B-11-10A)。

王欣(1972- )，女，遼寧蓋州人，講師，碩士，從事食品微生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。

2015-11-11

S 858.23

A

0517-6611(2015)35-231-03