王麗紅， 姜曉婷， 劉 暢， 姜春玲， 譚鳳田， 梅思琪

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江省第三醫(yī)院，黑龍江黑河 164000；3.江蘇萬邦醫(yī)藥營銷有限公司，江蘇徐州 221004)

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烏蘇里瓦韋抑菌作用研究

王麗紅1， 姜曉婷1， 劉 暢2， 姜春玲1， 譚鳳田3， 梅思琪1

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江省第三醫(yī)院，黑龍江黑河 164000；3.江蘇萬邦醫(yī)藥營銷有限公司，江蘇徐州 221004)

[目的]探討烏蘇里瓦韋的抑菌作用。[方法]以烏蘇里瓦韋為研究對象，在單因素的基礎(chǔ)上，選用Na+濃度、蔗糖濃度、不同的有機溶劑萃取物，采用正交試驗的原理，研究烏蘇里瓦韋提取液對抑菌作用的影響。[結(jié)果]烏蘇里瓦韋乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞球菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌均有抑制作用，但對枯草桿菌的抑制作用最強。最佳抑菌作用的條件為蔗糖濃度20%、Na+濃度為30%、烏蘇里瓦韋乙醇提取液的石油醚萃取物，測定對枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑為8.932 mm。[結(jié)論]烏蘇里瓦韋提取液具有抑菌作用。

烏蘇里瓦韋；抑菌作用；正交試驗

烏蘇里瓦韋[Lepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching]為蕨類水龍骨科瓦韋屬植物，別名石茶、樹茶、還陽草、大石韋等。據(jù)記載，該植物具有清熱解毒、利尿、止咳、止血、消腫等功效[1]。在我國分布于安徽、河南、山東、河北、遼寧、吉林、黑龍江[2]。民間多用于茶飲，具有良好的消腫、抗炎的功效。其化學(xué)成分綠原酸是一類重要活性物質(zhì)，該試驗研究烏蘇里瓦韋綠原酸提取液的體外抗菌作用，采用超聲提取法[3]，研究烏蘇里瓦韋的乙醇提取液對5種細菌的抑制效果，并通過單因素試驗和正交試驗研究最佳抑菌效果[4-9]，為其烏蘇里瓦韋的抑菌作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。烏蘇里瓦韋，采自佳木斯市湯原縣亮子河發(fā)電廠附近；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉(3 000～9 000)；生化試劑，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要設(shè)備及儀器 。KQ-250DE型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、SHB型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)、FA2004分析天平儀(上海恒平科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.1.3 試驗菌種。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞球菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌，均由佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配置。分別取烏蘇里瓦韋粉末2.0 g，采用超聲萃取法，用70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶68，超聲40 min，超聲3次，合并濾液。將提取液濃縮定容至10 ml容量瓶中，備用。精密吸取40、50、100、200、250、400、500、1000 μl烏蘇里瓦韋提取液，定容至10 ml容量瓶中。

1.2.2 篩選菌種試驗。采用烏蘇里瓦韋提取液，分別稀釋至50、25、12.5、6.28、3.13、2.01 mg/ml溶液，制作不同濃度的直徑為6 mm的藥敏紙片，取不同的菌種1 ml，均勻地涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，當(dāng)培養(yǎng)基表面干燥后，將紙片貼于培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基倒置在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，觀察并測定抑菌環(huán)直徑，重復(fù)3次。

1.2.3 單因素試驗。

1.2.3.1 不同萃取物的抑菌試驗。分別用石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇有機溶劑萃取烏蘇里瓦韋醇提取液，揮干有機溶劑后用蒸餾水定容至10 ml，按“1.2.2”方法進行抑菌試驗，篩選烏蘇里瓦韋抑菌成分的分布。

1.2.3.2 不同濃度的Na+溶液對抑菌試驗的影響。取烏蘇里瓦韋醇提物1 ml，采用5%、10%、15%、20%、30% NaCl溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按“1.2.2”方法進行抑菌試驗。

1.2.3.3 不同濃度的蔗糖的抑菌試驗。取烏蘇里瓦韋醇提物1 ml，用5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%蔗糖溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按照“1.2.2”方法進行抑菌試驗。

1.2.3.4 不同的金屬離子的抑菌試驗。取烏蘇里瓦韋醇提液1 ml，用Cu2+、Mg2+、Al3+、Zn2+離子溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按照“1.2.2”方法進行抑菌試驗。

1.2.4 烏蘇里瓦韋抑菌作用正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蔗糖濃度(A)、Na+濃度(B)、不同萃取物(C)為試驗因素，以抑菌環(huán)直徑為指標(biāo)，選用L9(33)正交表設(shè)計3水平3因素正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌種試驗

從圖1可以看出，烏蘇里瓦韋乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、糞球菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌這5種細菌均有抑制作用。烏蘇里瓦韋對枯草桿菌的抑制作用最佳濃度為2.010 mg/ml，對其他細菌的抑制作用較差，而在藥液濃度為25.068 mg/ml時，對糞球菌的抑菌效果最佳。在高濃度條件下，烏蘇里瓦韋提取液對糞球菌的抑制作用優(yōu)于其對其他細菌的抑制作用，而濃度較低時對枯草桿菌的抑制作用優(yōu)于其對其他細菌的抑制作用，但綜合資源利用以及最低抑菌濃度，枯草桿菌可作為抑菌試驗最終的菌種。

2.2 單因素試驗對抑菌作用的影響2.2.1

不同萃取物的抑菌試驗結(jié)果。有機溶劑正丁醇萃取物的抑菌效果最好，抑菌環(huán)直徑為9.63 mm，石油醚萃取物次之，抑菌環(huán)直徑為8.977 mm，二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯最弱，抑菌環(huán)直徑分別為6.310、6.987、6.431 mm，說明抑菌成分易溶于正丁醇。因為有機溶劑極性不同，所以不同有機溶劑提取的有效成分可能存在差異，發(fā)現(xiàn)有機溶劑正丁醇萃取物的抑菌效果最好。

2.2.2 不同濃度的Na+溶液對抑菌試驗的影響。當(dāng)Na+溶液濃度為15%時抑菌效果最好，烏蘇里瓦韋提取液的抑菌環(huán)直徑為10.083 mm，Na+溶液濃度為5%抑菌效果次之，抑菌環(huán)直徑為9.540 mm，Na+溶液濃度為30%時抑菌環(huán)直徑最小，為7.902 mm，說明不同濃度的Na+溶液對抑菌效果有一定影響。

2.2.3 不同濃度的蔗糖的抑菌試驗結(jié)果。當(dāng)蔗糖濃度為5%時，烏蘇里瓦韋提取液的抑菌效果最好，抑菌環(huán)直徑為8.651 mm，隨著蔗糖濃度逐漸增大，抑菌環(huán)直徑降低為7.290 mm，說明蔗糖濃度繼續(xù)增大，抑菌環(huán)直徑?jīng)]有明顯增加，抑菌效果沒有明顯變化。

2.2.4 不同的金屬離子的抑菌試驗結(jié)果。當(dāng)加入Cu2+、Mg2+抑菌效果較好，加入Cu2+后抑菌環(huán)直徑為7.432 mm，加入Mg2+后抑菌環(huán)直徑為7.674 mm，添加Al3+、Zn2+后抑菌環(huán)直徑最小，分別為6.881、6.853 mm。

2.3 烏蘇里瓦韋抑菌作用正交試驗

由表1可知，單因素中不同萃取物對抑菌效果影響最大，其次是Na+濃度、蔗糖濃度。最優(yōu)組合為A2B3C1，即采用石油醚進行萃取，Na+濃度為30%，蔗糖濃度為20%。

表1 烏蘇里瓦韋抑菌試驗的正交設(shè)計

根據(jù)烏蘇里瓦韋抑菌試驗正交表得出的最優(yōu)試驗條件進行添加各種因素，最終得抑制枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑為8.932 mm，抑菌效果高于試驗中任何一個組合，表明蔗糖濃度為 20%、Na+濃度為 30%、烏蘇里瓦韋采用石油醚萃取液具有最佳抑菌作用。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明烏蘇里瓦韋的乙醇提取物具有抑菌作用，各因素中不同有機溶劑萃取烏蘇里瓦韋的乙醇提取液對抑菌效果影響最大，其次是Na+濃度、蔗糖濃度。在此試驗中，烏蘇里瓦韋萃取物濃度與蔗糖濃度對抑菌效果相比，抑菌環(huán)直徑最大可達9 mm以上，抑菌效果較明顯，說明烏蘇里瓦韋具有較強的抑菌作用，有待于進一步開發(fā)利用。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第二冊[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:238.

[2] 中國科學(xué)院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志：第6(2)卷[M].北京：科學(xué)出版社,2000.

[3] 王麗紅,譚鳳田,趙宏.等.Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化烏蘇里瓦韋中綠原酸提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014,20(17):24.

[4] 華波.重慶特有植物荷葉鐵線藏Adiantumreniformevar.sinense多糖和黃酮的提取、抗氧化及抑菌特性研究[D].重慶：西南大學(xué),2011.

[5] 鐘愛清.三種蕨類醇提液抑菌性的初步研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2011(9):66-68.

[6] 梁曉華,梁曉東,郎曉麗,等.6種藥用蕨類植物提取液的抑菌試驗[J].中藥材,2011,34(7):1107-1110.

[7] 許柑葉,鄭怡,陳曉清.8種蕨類植物多糖提取物抑菌效果的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,21(2):99-102.

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[9] 殷帥文,王莊先,聶森,等.幾種蕨類植物抑菌活性的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(4):1492-1493.

Antibacterial Action ofLepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching

WANG Li-hong1,JIANG Xiao-ting1,LIU Chang2et al

(1.College of pharmacy,Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154007;2.Third Hospital of Heilongjiang Province,Heihe,Heilongjiang 164000)

[Objective] The research aimed to approach antibacterial effect ofLepisorusussuriensis.[Method]WithLepisorusussuriensisas the research object,based on a single factor,using Na+concentration, sucrose concentration and different organic solvent extracts,the effect of the extract liquid ofLepisorusussuriensison bacteriostatic action was studied by the principle of orthogonal test.[Result]Ethanol extract liquid ofLepisorusussuriensishad a good inhibitory effect on staphylococcus aureus,escherichia coli,fecal bacteria,bacillus subtilis and salmonella,especially to the bacillus subtilis. When the sucrose concentration was 20%, and Na+concentration was 30%,Lepisorusussuriensisbacteriostatic had the best effect on petroleum ether extract, eventually, it turns out that the diameter of the bacteriostatic ring was 8.932 mm.[Conclusion]Lepisorusussuriensisextract liquid had bacteriostatic action.

Lepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching; Antibacterial action; Orthogonal test

佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(2014xj010);佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(LM2014_065);佳木斯大學(xué)博士基金項目(22zb201513)。

王麗紅(1968- )，女，遼寧海城人，教授，博士，從事植物藥的開發(fā)及利用研究。

2015-11-13

S 567

A

0517-6611(2015)35-215-02