冷鵬，李親凱，劉素

(1.山東城市建設(shè)職業(yè)學(xué)院，濟(jì)南 250103； 2.濟(jì)南大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250022)

2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)是一種無臭無味但熱穩(wěn)定性良好的白色或淺黃色結(jié)晶體。BHT作為人工合成的抗氧化劑，屬于油溶性抗氧化劑，目前在我國生產(chǎn)量很大［1］。人們常在食品中添加適量的BHT以延遲和阻止食品氧化變質(zhì)，但過量接觸和攝入容易對(duì)人體造成嚴(yán)重危害，如使人體呼吸酶的活性受到抑制，致癌等［2］。為防止和限制食品中BHT的添加使用量超標(biāo)，GB／T 2760–1996明確規(guī)定了其使用量限值為0.2 g／kg［3］。目前，用于檢測食品中BHT含量的方法很多，其中常用的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法、光度法及在線分析技術(shù)等［4–9］。這些方法靈敏度高，但儀器昂貴、樣品預(yù)處理復(fù)雜，且測試人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)才能完成檢測。生物傳感檢測是食品安全領(lǐng)域中的熱門檢測方法之一，生物體中的酶、抗體、組織等均具有特異性識(shí)別特定物質(zhì)的能力，可以作為生物傳感器的識(shí)別分子［10］。生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)是專一程度高、檢測速度快、操作相對(duì)簡單。不足之處在于穩(wěn)定性差、構(gòu)建成本高且重復(fù)利用率低。分子印跡技術(shù) (Molecular Imprinting Technology，MIT)就是把某一特定化學(xué)物質(zhì)當(dāng)作目標(biāo)模板，制備對(duì)其特異性識(shí)別的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)的過程［11–12］。該識(shí)別類似于抗原與抗體、酶與底物及激素藥物與受體等，具有高度的專一性和特異性。分子印跡聚合物具有結(jié)構(gòu)可控性好、環(huán)境耐受性好且易于保存等特點(diǎn)，這種用聚合物作為識(shí)別元件構(gòu)建得到的仿生傳感器，足以克服上述生物傳感器的諸多缺點(diǎn)［13］。筆者以BHT為檢測目標(biāo)，利用分子印跡技術(shù)和表面修飾技術(shù)構(gòu)建了一種基于納米材料增效的BHT分子印跡電化學(xué)傳感器(以下簡稱分子印跡傳感器)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器與試劑

電化學(xué)工作站：VersaSTAT3型，美國阿美特克公司；

磁力攪拌器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；

電子天平：EL204型，梅特勒–托利多儀器有限公司；

三電極系統(tǒng)：鉑絲電極為對(duì)電極，Ag／AgCl電極為參比電極，修飾后的金電極為工作電極；

超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；

石墨粉、高錳酸鉀、濃硫酸、鹽酸、氯金酸(HAuCl4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)、乙醇、甲醇、BHT、冰乙酸、硼氫化鈉(NaBH4)、鄰氨基苯硫酚(o-ATP)：分析純，阿拉丁有限公司(上海)；

磷酸緩沖液(PBS)：用磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)和NaCl配制；

植物油脂：市購；實(shí)驗(yàn)用水為超純?nèi)ルx子水；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑為分析純。

1．2 傳感器的制備

1.2.1 石墨烯的制備

將1 g石墨粉和0.5 g硝酸鈉加入到50 mL濃硫酸中，攪拌，再分多次將6 g高錳酸鉀加入到上述混合液中，于20℃水??；攪拌1 h后，于35℃水浴30 min，加入100 mL去離子水，持續(xù)攪拌20 min；加入適量的雙氧水，得溶液變成亮黃色后，趁熱過濾，用鹽酸洗滌，直至濾液中無硫酸根被檢出。將獲得固體置于真空干燥箱中，于60℃干燥2 h；稱取干燥物100 mg，于100 mL蒸餾水中超聲振蕩1 h后真空干燥，即得氧化石墨烯粉末。

稱取0.06 g氧化石墨烯置于盛有60 mL水的燒杯中，超聲分散8 h，加入1.5 mL PSS和0.5 mL水合肼，于90℃攪拌24 h，得到黑色分散液，用水沖洗多次，將所得物質(zhì)超聲分散到15 mL水中，得到石墨烯溶液［14］。

1.2.2 鄰氨基苯硫酚功能化納米金(F-AuNPs)的制備

將32 mg氯金酸加入到10 mL乙醇中，將6 mg鄰氨基苯硫酚(o-ATP)加入到5 mL甲醇中，將二者混合，進(jìn)行冰浴(0℃)并攪拌1 h，期間加入0.4 mL冰乙酸，得到黑褐色懸浮液。然后往該懸浮液中逐滴加入2.5 mL 0.5 mol／L NaBH4溶液，并繼續(xù)在冰浴環(huán)境中攪拌1 h，將得到的褐色溶液在室溫下靜置10 h。去除上清液，將剩余沉淀部分混勻，分批裝入離心管內(nèi)，以1×104r／min離心10 min。將離心后所得到的沉淀依次用水洗滌多次，并分別用甲醇和乙醇溶液各洗滌2次。

1.2.3 分子印跡聚合物溶液的制備

取適量pH 6.5的PBS溶液，向溶液中加入適量BHT和F-AuNPs，溶液的濃度為5×10–3mol／L，于黑暗環(huán)境中靜置5 h以上，以此完成預(yù)組裝過程，即得到分子印跡聚合物溶液。

1.2.4 分子印跡傳感器界面的構(gòu)建

分子印跡傳感器的構(gòu)建如圖1所示。用移液槍吸取10 μL石墨烯均一溶液滴加到已處理好的金電極表面，室溫下過夜干燥；采用電聚合的方式將分子印跡聚合物沉積到石墨烯修飾電極表面［15–16］，電化學(xué)工作站掃描電壓為0.35～0.85 V，掃描速率為50 mV／s，掃描20圈。聚合物干燥后，采用0.1 mol／L的鹽酸溶液將模板分子BHT洗脫，即得到分子印跡電化學(xué)傳感器。

按照相同的構(gòu)建程序組建非分子印跡傳感器，構(gòu)建過程中的電聚合使用的聚合物不包含模板分子BHT。

圖1 分子印跡傳感器的構(gòu)建原理

1．3 樣品預(yù)處理

以花生油作為檢測樣品，預(yù)處理程序：2.0 g樣品與5 mL乙醇充分融合12 h；分別取1.0 mL懸浮液以PBS溶液稀釋，備用。

1．4 電化學(xué)測量

修飾電極的表征在含有5 mmol／L K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L KCl水溶液中通過循環(huán)伏安法完成，掃描速率為50 mV／s，電壓范圍為–0.2～0.6 V。其它實(shí)驗(yàn)通過差分脈沖伏安法完成，將修飾好的電極分別放入5 mmol／L的K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L的KCl水溶液中，電壓范圍為–0.2～0.6 V，掃描速率為5 mV／s。

2 結(jié)果與討論

2．1 電極修飾過程的循環(huán)伏安表征

通過循環(huán)伏安法對(duì)傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行表征，電極修飾過程的循環(huán)伏安曲線見圖2。a為裸電極循環(huán)伏安曲線；b為石墨烯修飾金電極的循環(huán)伏安曲線，由于石墨烯可以促進(jìn)電子傳輸，該氧化還原峰電流響應(yīng)相比于裸電極電流響應(yīng)有明顯的增加；c為電聚合分子印跡聚合物后的循環(huán)伏安曲線，與曲線b相比，電信號(hào)有了顯著下降，這是因?yàn)榉肿佑≯E聚合膜阻斷了電極表面的電子傳遞：d為洗脫模板分子以后的循環(huán)伏安曲線，電信號(hào)有一定的增強(qiáng)，這是由于模板分子被洗脫掉之后，電極表面形成很多孔穴，這些孔穴增加了電子傳遞的有效表面積，促進(jìn)了電子傳遞，進(jìn)而提高了電極的電流響應(yīng)。

a—裸金電極； b—石墨烯／金電極； c—MIPs／石墨烯／金電極；d—洗脫之后的MIPs／石墨烯／金電極圖2 電極修飾過程的循環(huán)伏安曲線

2．2 掃描圈數(shù)對(duì)分子印跡傳感器電流響應(yīng)的影響

不同的掃描圈數(shù)會(huì)對(duì)電聚合膜厚度產(chǎn)生影響，而不同厚度的電聚合膜的分子印跡傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度不同，采用循環(huán)伏安法對(duì)不同電聚合掃描圈數(shù)(5，10，15，20，25)的傳感器電流響應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。由圖3可見，當(dāng)掃描圈數(shù)從5增加到20時(shí)，傳感器的電流響應(yīng)隨之增大并達(dá)到最大值。這是因?yàn)楫?dāng)電聚合圈數(shù)少于20圈時(shí)，電聚合膜會(huì)因?yàn)樘《菀灼屏?，因此傳感器的電流響?yīng)相對(duì)較??；當(dāng)掃描圈數(shù)大于20時(shí)，電聚合膜會(huì)因?yàn)樘穸沟媚０宸肿硬蝗菀妆幌疵摚仕鶞y得的傳感器電流響應(yīng)有所下降。綜上考慮，選擇最佳掃描圈數(shù)為20圈。

圖3 電聚合掃描圈數(shù)對(duì)傳感器電流的影響

2．3 模板分子和功能單體摩爾比的優(yōu)化

由不同模板分子和功能單體的摩爾比構(gòu)建得到的傳感器其性能有很大不同，因此需要對(duì)不同模板分子和功能單體的摩爾比進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)模板分子與功能單體的摩爾比高于1∶1時(shí)，電流響應(yīng)相對(duì)較小，這是因?yàn)槿艄δ軉误w的數(shù)量過少，可能導(dǎo)致其不能與模板分子進(jìn)行充分結(jié)合；當(dāng)模板分子與功能單體的摩爾比低于1∶1時(shí)，電流響應(yīng)同樣不斷下降，這可能是因?yàn)槟０宸肿拥臄?shù)量太少而使功能單體過多地占據(jù)電極表面，從而導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)過少，使電流響應(yīng)不斷下降。當(dāng)模板分子與功能單體的摩爾比為1∶1時(shí)，傳感器的電流響應(yīng)達(dá)到最大。

圖4 模板分子與功能單體的摩爾比對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

2．4 洗脫時(shí)間的優(yōu)化

傳感器的識(shí)別能力與洗脫時(shí)間的長短密切相關(guān)，洗脫時(shí)間過長整個(gè)電聚合膜容易被洗脫掉；太短則模板分子不能被洗脫。因此用0.1 mol／L的鹽酸溶液分別對(duì)傳感器沖洗 5，10，15，20，25 min，并對(duì)傳感器的電流響應(yīng)進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。

圖5 不同洗脫時(shí)間對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

由圖5可知，當(dāng)洗脫時(shí)間低于10 min時(shí)，傳感器的電流響應(yīng)逐漸增大并達(dá)到最大，很明顯模板分子被洗脫之后電極表面不斷形成很多孔穴，這些孔穴增加了電子傳遞的有效表面積，促進(jìn)了電子傳遞，進(jìn)而提高了電極的電流響應(yīng)；當(dāng)洗脫時(shí)間大于10 min時(shí)，電極表面修飾的聚合物與石墨烯會(huì)被洗脫掉，不能促進(jìn)電子傳輸，故電流響應(yīng)不斷減小。因此選擇洗脫時(shí)間為10 min。

2．5 分子印跡傳感器孵化時(shí)間優(yōu)化

將構(gòu)建的分子印跡傳感器在5×10–3mol／L的BHT 溶液中分別浸泡 5，10，15，20，25 min，再對(duì)傳感器的響應(yīng)電流進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，孵化時(shí)間由5 min增大到20 min時(shí)電流響應(yīng)不斷增加，這是因?yàn)樵诖朔趸瘯r(shí)間段內(nèi)，模板分子在傳感器上的結(jié)合效果隨時(shí)間的延長而變得更好；當(dāng)孵化時(shí)間超過20 min，傳感器表面的修飾物石墨烯和聚合物會(huì)脫落，故電流響應(yīng)又會(huì)下降。因此最優(yōu)孵化時(shí)間為20 min。

圖6 不同孵化時(shí)間對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

2．6 分子印跡傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了研究構(gòu)建得到的分子印跡傳感器的分析性能，利用DPV法對(duì)其線性檢測范圍和最低檢測限(LOD)進(jìn)行測定。首先構(gòu)建分子印跡和非分子印跡兩類電傳感器，然后將其在含有BHT的PBS緩沖液中浸泡20 min，進(jìn)行DPV檢測，檢測結(jié)果見圖7。

a—分子印跡傳感器； b—非分子印跡傳感器圖7 傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖7可知，分子印跡傳感器的檢測范圍為5×10–6～1×10–2mol／L，最低檢測限為 1.56×10–6mol／L。非分子印跡傳感器的電流響應(yīng)和電流變化很小，不具備特異性識(shí)別BHT的能力。

2．7 分子印跡傳感器的特異性分析

選取幾種與BHT結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)作為干擾物，包括叔丁基氫醌(TBHQ)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)和沒食子酸丙酯(PG)，以此來驗(yàn)證所構(gòu)建得到的分子印跡傳感器對(duì)模板分子的專一選擇的特性。其電流響應(yīng)見圖8。由圖8可見，分子印跡傳感器的電流響應(yīng)比非分子印跡傳感器的電流響應(yīng)大，而且分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)BHT的選擇性好。

a—5×10–3 mol／L BHT 溶液； b—5×10–3 mol／L TBHQ ；c—5 ×10–3 mol／LBHA 溶液；d—5×10–3 mol／LPG 溶液圖8 分子印跡和非分子印跡傳感器對(duì)BHT選擇性識(shí)別

2．8 分子印跡傳感器的再現(xiàn)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性

最優(yōu)條件下組建5支傳感器，每支電極只檢測一次濃度為 5×10–3mol／L 的 BHT 溶液，電流響應(yīng)測 定 結(jié) 果 為 244.22，243.87，242.90，243.29，243.57 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%，表明傳感器具有良好的再現(xiàn)性。在相同條件下組建5支分子印跡電化學(xué)傳感器，每支傳感器檢測5×10–3mol／L BHT溶液電流響應(yīng)測定結(jié)果為 243.51，243.57，243.63 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%。結(jié)果說明構(gòu)建的傳感器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)BHT的重復(fù)性檢測。制備3支傳感器，于室溫下保存2周，檢測傳感器的電流響應(yīng)，得到的電流