劉向飛，蔣 棟，趙振杰，李 欣

(1.華東師范大學(xué) 納光電集成與先進(jìn)裝備教育部工程研究中心，上海200062;2.華東理工大學(xué) 分析測試中心，上海200237)

0 引 言

氧化鋅(ZnO)納米材料作為一種II－VI 族半導(dǎo)體納米材料，具有較好的光學(xué)和電學(xué)響應(yīng)，被廣泛用于太陽能電池、紫外傳感器、場發(fā)射器件等［1］。同時，ZnO 納米材料還具有比表面積高、電子遷移率高、電化學(xué)活性和化學(xué)穩(wěn)定性等特點，可結(jié)合場效應(yīng)管［2］、壓電效應(yīng)［3］、電化學(xué)檢測［4］、光學(xué)檢測［5］等技術(shù)研制不同類型高靈敏度的生物傳感器。近年來，多項研究工作表明:ZnO 納米材料在生物醫(yī)學(xué)檢測的應(yīng)用上得到了快速發(fā)展［6］，具有廣闊的應(yīng)用前景。其中，一維ZnO 納米材料能提高熒光檢測性能［7，8］，用于研制新型的生物熒光檢測器，深化了熒光檢測在生物學(xué)、疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用［9，10］。然而，不斷發(fā)展的高通量檢測對ZnO 納米材料的制備工藝、器件集成提出了新的要求。

目前，ZnO 納米材料的制備主要包括水熱法［11］、化學(xué)氣相沉積法［12］、電化學(xué)沉積法［13］等。其中，水熱法具有成本低廉、工藝簡單、可操作性強(qiáng)等特點［14］，便于工藝的集成與器件的研制。然而常規(guī)水熱法合成中，反應(yīng)物會不斷消耗，只能通過更換生長液來獲得較長的納米棒。目前，在微流控芯片中合成ZnO 納米棒，生長溶液可不斷更新，有利于保持反應(yīng)物濃度的穩(wěn)定，從而獲得較長的ZnO 納米棒，并用于檢測pH 值、研制氣體傳感器等［15，16］。同時，微流控芯片具有微型化、消耗少、便于集成等特點，與傳統(tǒng)熒光檢測器件相比，集成了納米材料的高靈敏度芯片傳感器具有突出的優(yōu)勢，是生物檢測技術(shù)發(fā)展的重要方向［17］。

本文提出在具有陣列式微通道的微流控芯片中，利用種子法和水熱合成技術(shù)制備ZnO納米棒，通過對樣品的表征和測試，比較并分析了采用常規(guī)條件和微通道芯片制備的ZnO 納米棒的結(jié)構(gòu)和形貌特征。同時，本文建立了基于陣列式微通道的ZnO 納米棒生物熒光檢測方法，以異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗牛IgG 抗體為例對ZnO 納米棒的熒光檢測性能進(jìn)行了研究。

1 實 驗

1.1 試 劑

其中，六水硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、六亞甲基四胺(HMTA)、二水乙酸鋅(C4H6O4Zn·2H2O)、氨水(NH3·H2O)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，聚乙烯醇(PVA)、聚醚酰亞胺(PEI)購自美國Sigma－Aldrich 公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗牛IgG 抗體(FITC－antiIgG)購于美國ImmunoReagents公司。

1.2 種子層的制備

采用溶膠—凝膠法和旋涂法制備ZnO 種子層。方法如下:首先，稱取0.25 g PVA 溶解于5 mL 去離子水中，70 ℃下攪拌1 h 形成透明液體;冷卻后加入0.05 g 的乙酸鋅，室溫下攪拌2 h 得到種子溶液。然后，將種子溶液旋涂在載玻片上，轉(zhuǎn)速為3 000 rpm，時間為1 min。最后，將得到的薄膜在500 ℃下熱處理3 h，得到ZnO 的種子層。

1.3 ZnO 納米棒的制備

本文采用水熱法分別用在常規(guī)條件下和微通道中制備ZnO 納米棒。

ZnO 生長溶液的制備:分別將0.744 g Zn(NO3)2·6H2O，0.175 g HMTA，0.4 g PEI 溶解于100 mL 去離子水中，再緩慢加入1.5 mL NH3·H2O 攪拌均勻并調(diào)節(jié)pH 值至10.6。

常規(guī)條件下水熱法制備ZnO 納米棒:將種子層基底正面向下放入生長溶液中，距離容器底部約1 cm 處，在90 ℃溫度下生長3 h。最后取出樣品用去離子水沖洗并用氮氣吹干。

微通道中水熱法制備ZnO 納米棒:具有陣列微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片是用軟光刻工藝制備的。芯片模板購自武漢介觀生物科技有限責(zé)任公司，通道長度為1.5 cm，寬度為500 μm，高度為50 μm。制備ZnO 納米棒時，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道用氧等離子體處理后置于ZnO 種子層上方并密封(圖1)。其后，用注射泵(流速為10 μL/min)將生長溶液通入微通道中，在90 ℃溫度下生長3 h。最后，用去離子水沖洗通道并用氮氣吹干，得到ZnO 納米棒陣列。

1.4 樣品的表征

采用原子力顯微鏡(AFM，Nano Wizard II)分析ZnO 種子層表面形貌，使用掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S—4800)和X 射線衍射儀(XRD，Rigaku，Ultima IV)分別對ZnO 納米棒的表面形貌和晶體結(jié)構(gòu)的特性進(jìn)行表征。

圖1 微流控芯片中制備ZnO 納米棒陣列的示意圖Fig 1 Diagram of ZnO nanorods arrays fabricated by microfluidic chip

1.5 FITC－antiIgG 的檢測

將FITC－antiIgG 溶于pH 值為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配置不同濃度的FITC－antiIgG 溶液(1×10－6～100 μg/mL)，以5 μL/min 的流速通入微通道中，10 min 后用PBS 和去離子水清洗并用氮氣吹干。所有樣品采用熒光顯微鏡(重慶奧特BDS200—FL)觀察，對所得圖像用imageJ 進(jìn)行處理，分析熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnO 納米棒的表征分析

為研究微通道中制備的ZnO 納米棒形貌特征，分析與常規(guī)條件下制備樣品的差異，本文利用SEM 對兩種條件制備的ZnO 納米棒形貌進(jìn)行了表征，如圖2 所示。分析SEM照片可得，常規(guī)條件下制備的ZnO 納米棒的平均直徑、長度分別為0.05，1.26 μm，取向稍顯雜亂。微通道中制備的ZnO 納米棒的平均直徑、長度分別為0.1，10 μm，且垂直于基底生長。微通道中制備的納米棒的長度和直徑均有顯著增加，且密度較小。造成尺寸差異的主要原因是在常規(guī)條件下制備ZnO 納米棒時，基底表面反應(yīng)物的更新主要依靠擴(kuò)散來完成。然而在微通道中制備ZnO 納米棒時，反應(yīng)物的更新主要依靠生長液的灌流，使生長表面保持較穩(wěn)定的濃度。所以，ZnO 納米棒的直徑和長度均有顯著增加。同時，鄰近的納米棒出現(xiàn)了融合生長的現(xiàn)象，導(dǎo)致其密度降低，并于底部逐漸融合成薄膜。

圖2 不同合成條件下ZnO 納米棒的SEM 圖Fig 2 SEM images of ZnO nanorods synthesized in various conditions

為了分析制備的ZnO 納米棒的晶體結(jié)構(gòu)，本文對兩種合成條件下的ZnO 納米棒進(jìn)行了X 射線衍射分析，如圖3所示，兩種ZnO 納米棒具有相似的XRD 圖譜。通過對比標(biāo)準(zhǔn)譜圖(JCPDS NO.36—1451)，兩種合成條件下的ZnO 納米棒均為六方纖鋅礦結(jié)構(gòu)，(002)方向的衍射峰最強(qiáng)，說明其良好的c 軸取向性和結(jié)晶度。微通道中制備的ZnO 納米棒的(002)衍射峰強(qiáng)度約為常規(guī)方法的4 倍，表明微通道在制備c 軸取向性好的ZnO 納米棒方面更有優(yōu)勢。

圖3 不同合成條件下ZnO 納米棒的XRD 圖Fig 3 XRD patterns of ZnO nanorods synthesized in different conditions

2.2 ZnO 納米棒熒光檢測性能分析

本文以10 μg/mL 的FITC－antiIgG 為模型分子研究了ZnO 納米棒的熒光檢測性能。首先，分別以玻璃、ZnO 種子層、微通道中制備的ZnO 納米棒為載體，在微通道中對蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了檢測，如圖4(a)所示?？梢姡ＡШ蚙nO種子層載體上觀察不到熒光信號，而微通道中制備的ZnO納米棒載體的熒光信號清晰可見。從熒光強(qiáng)度的分布(圖4(b))也可以發(fā)現(xiàn)，玻璃和ZnO 種子層上的熒光強(qiáng)度與背景信號相似，而微通道中制備的ZnO 納米棒熒光信號顯著增強(qiáng)，是蛋白樣品的良好載體。

圖4 不同載體上FITC-antiIgG 的熒光照片與熒光強(qiáng)度分布Fig 4 Fluorescent photos and fluorescence intensity profile of FITC-antiIgG on different carriers

本文還利用陣列式微通道制備的ZnO 納米棒在各通道中檢測不同濃度FITC－antiIgG 的熒光強(qiáng)度，如圖5 所示。通道1～11 的檢測濃度分別為0，1×10－6，1×10－5，1×10－4，1×10－3，0.01，0.1，1，10，50，100 μg/mL。從圖5(a)，(b)中可以看出:隨著蛋白濃度從0 增加到100 μg/mL，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過分析熒光強(qiáng)度(圖5(c))可以發(fā)現(xiàn)，利用ZnO 納米棒檢測蛋白，在低濃度范圍內(nèi)有很好的響應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?×10－6，1×10－5μg/m 時，熒光信號強(qiáng)度接近于背景信號。濃度在1×10－4～10 μg/mL 范圍內(nèi)，如圖5(c)中插圖所示，熒光強(qiáng)度與蛋白濃度的對數(shù)值基本呈線性變化，檢測限為10－4μg/mL。濃度繼續(xù)增大到50 μg/mL 后，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。實驗結(jié)果表明:微通道中制備的ZnO 納米棒可用于生物蛋白的檢測，具有較高的檢測靈敏度。此外，運(yùn)用陣列式微通道的芯片，可同時檢測多種樣品，減少樣品消耗，降低檢測成本。

圖5 ZnO 納米棒上FITC-antiIgG 的熒光照片、熒光強(qiáng)度分布及熒光強(qiáng)度隨濃度的變化Fig 5 Fluorescent photos intensity profiles of FITC-antiIgG on ZnO nanorods platform change of fluorescence intensity with concentration

ZnO 納米棒載體熒光增強(qiáng)效應(yīng)的機(jī)制主要包括兩個方面。首先，ZnO 納米棒具有高等電點，在中性緩沖液中，ZnO 納米棒表面富集正電荷，是檢測生物分子的優(yōu)良載體［6］;其次，ZnO 納米棒作為波導(dǎo)傳輸光信號時，光場沿軸向傳播，在納米棒外部形成消逝場，使穿透深度范圍內(nèi)的熒光分子得到更強(qiáng)的激發(fā)［18］。和常規(guī)方法相比，微通道中制備的ZnO 納米棒的直徑和長度較大，比表面積高，有利于蛋白吸附。同時，微通道中制備的ZnO 納米棒結(jié)晶性和取向性更好，有利于光傳輸和熒光信號檢測，對檢測低濃度樣品具有重要作用。

3 結(jié) 論

本文利用水熱法，在陣列式微通道中制備了ZnO 納米棒，建立了一種基于微通道的生物熒光檢測方法，并研究了ZnO 納米棒的熒光檢測性能，對FITC－antiIgG 的檢測限可達(dá)1×10－4μg/mL。結(jié)果表明:和常規(guī)條件下制備的ZnO 納米棒相比，微通道中制備的ZnO 納米棒的比表面積、結(jié)晶性和c 軸取向性均有較大提高，可顯著增強(qiáng)熒光信號。利用陣列式微通道芯片可同時檢測多種樣品，提高檢測效率，為研制高通量、高靈敏度生物熒光檢測傳感器提供了一種新方法和研究依據(jù)。

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