郭書巧， 束紅梅， 鞏元勇， 蔣 璐， 朱靜雯， 倪萬潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，江蘇 南京 210095)

細胞色素P450(P450)廣泛存在于各種形式的生命體中，它是自然界中最大且最古老的家族［1-2］。在植物中，P450主要參與植物體內(nèi)初級和次級代謝反應(yīng)，并發(fā)揮重要的催化作用。其催化反應(yīng)的底物包括內(nèi)源性物質(zhì)，如脂類、黃酮類、萜類、生物堿類等以及外源性物質(zhì)，如農(nóng)藥、除草劑等［3］。P450底物與功能的多樣性是為了適應(yīng)各種組織中不同的代謝途徑和環(huán)境脅迫而進化的結(jié)果［4］。

菊科中含有多種芳香族植物，其中青蒿屬(Artemisiaannua)植物能產(chǎn)生一種倍半萜內(nèi)酯過氧化物—青蒿素，青蒿素是目前世界公認的抗瘧疾首選藥物。紫穗槐-4，11-二烯(Amorphadiene)合酶是一種來源于青蒿的細胞色素P450單加氧CYP71AV1，它是一種多功能倍半萜內(nèi)酯環(huán)化酶，能將萜類前體法尼基焦磷酸(FPP)氧化成紫穗槐-4，11-二烯(Amorpha-4，11-diene)，并進一步氧化成青蒿素合成的前體青蒿酸(Artemisinic acid)［5］。同時青蒿中還含有大量其他萜類化合物，青蒿植物精油主要成分包括單萜和倍半萜［6-7］。因此，了解青蒿P450，對于進一步了解P450在植物初生代謝和次生代謝中的作用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的青蒿(A.annua)P450氨基酸序列下載自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/?term=Artemisia+P450)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，水稻(Oryzas ativa)和擬南芥(Arabidopsis thaliana) P450氨基酸序列下載自P450蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html)。

1.2 方法

1.2.1 菊科植物青蒿P450基因的鑒定 從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載菊科植物青蒿中所有的P450全長序列，對其逐一進行氨基酸的一致性鑒定。對還沒有進行家族分類的P450進行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結(jié)合下載的擬南芥和水稻序列尋找與其一致性較高序列。根據(jù)國際命名標準對其進行分類:氨基酸序列一致性(Identity)在40%至55%之間的序列為同一家族(Family)，一致性為55%～97%的序列歸入同一亞家族(Subfamily)，氨基酸序列的一致性大于97%的序列是由同一基因的不同位點即等位基因編碼［8］。

1.2.2 菊科植物青蒿P450系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 根據(jù)青蒿P450的氨基酸序列，通過MUSCLE［9］對所鑒定的P450氨基酸序列進行比對，采用MEGA 6.0軟件Neighbor joining法構(gòu)建進化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次［10］。

1.2.3 青蒿和擬南芥、水稻P450系統(tǒng)進化樹對比

在水稻和擬南芥P450中選擇在青蒿中存在的11個家族所有P450全長氨基酸序列，采用MEGA 6.0軟件中Neighbor joining法對已鑒定的青蒿中氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次［10］。

1.2.4 青蒿P450蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1 青蒿P450蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)理化特性分析

利用在線軟件Protparam(http://web.expasy.org/ protparam)對氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、理論等電點、分子式、脂肪族氨基酸、蛋白質(zhì)疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)等蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)理化特性進行分析。

1.2.4.2 青蒿P450蛋白質(zhì)亞細胞定位和信號肽預(yù)測 使用 TargetP在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對青蒿 P450蛋白質(zhì)進行亞細胞定位［11］。信號肽預(yù)測使用在線軟件SingaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行［12］。

1.2.4.3 青蒿P450蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析 利用ExPaSy在線程序SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測分析α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角等;蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)信息來源于 RCSB PBD(http://www.rcsb.org)，共 4個細菌 P450［P450cam(CYP101)、P450BM3(CYP102)、P450eryF(CYP107A1)和P450terP(CYP108)］，1 個 哺 乳 動 物 P450 (CYP2C5)，1個擬南芥丙二烯氧化合酶(CYP74A，)1個灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)丙二烯氧化合酶AOS(CYP74A2)［13］。將6個氨基酸序列與青蒿的P450用ClustalW軟件進行同源比對，選擇一致性較高的P450(CYP2C5)為模板［14］，應(yīng)用在線ESPript程序(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進行二級結(jié)構(gòu)及基質(zhì)結(jié)合位點的的預(yù)測［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊科植物青蒿P450基因的鑒定結(jié)果

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中共下載76條青蒿P450蛋白質(zhì)氨基酸序列。其中具有全長的氨基酸序列57條，包含8條P450還原酶蛋白質(zhì)氨基酸序列。將剩余的49條序列進行氨基酸的一致性鑒定，最后獲得41個編碼細胞色素P450單加氧酶的基因(表1)，其中有14個基因目前沒有經(jīng)過正式的家族分類。對沒有分類的P450進行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并結(jié)合下載的擬南芥和水稻P450氨基酸序列找到與其一致性較高的序列，對其進行進一步確認，鑒定結(jié)果見表2。

2.2 青蒿P450基因系統(tǒng)進化

從青蒿P450系統(tǒng)進化樹(圖1)可以看出，青蒿的41個基因分布相對集中，共分布在3個基因簇的11個家族中。其中 Clan72中的 CYP72有2個，Clan85中的CYP90有1個，CYP716有4個。其余全部分布于Clan 71中，且大多集中在CYP71家族中。來源于青蒿中的16個基因，除AaABG49366.1外，都在一個分支中，一致性在97%～99%，在分類上被視為同一基因的等位基因［8］。來源于青蒿屬的其他物種的P450一致性為82%～86%。

表1 預(yù)測的青蒿細胞色素P450基因分布Table 1 Distribution of the P450 genes from Artemisia annua

表2 預(yù)測的青蒿細胞色素P450與其同源序列的一致性Table 2 Similarity of P450 amino acid sequence from A.annua and other species

2.3 青蒿、擬南芥和水稻P450系統(tǒng)進化樹的對比

從青蒿和擬南芥和水稻的P450系統(tǒng)進化樹(圖2)中可以看出，雙子葉植物擬南芥中所特有的［21］，水稻中不存在的CYP82、CYP83和CYP716 3個家族在青蒿中都出現(xiàn)了。有趣的是在擬南芥中不存在，而在單子葉植物中特有的CYP92家族居然在青蒿中出現(xiàn)。而Nelson等［21］提到的菊科中出現(xiàn)的8個家族 CYP73、CYP75、CYP76、CYP81、CYP93、CYP701、CYP74、CYP87，在青蒿中只有 CYP73和CYP81 2個家族出現(xiàn)。

2.4 青蒿P450蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性

選擇代表不同家族和亞家族的19個青蒿P450分析其特征特性。代表性P450氨基酸數(shù)為473～528，平均為500;相對分子量在53 977.9至61 127.3之間，平均為56 882.1(表3)。根據(jù)理論等電點(pI)將青蒿P450蛋白質(zhì)分為2類:一類呈酸性，pI值介于6.00和6.69之間，包括CYP706、CYP83和 CYP82共3個家族中的5個蛋白質(zhì);另一類呈堿性，pI值介于8.03和9.25之間，包括CYP90、CYP716、CYP73、CYP72、CYP92、CYP71、CYP81、CYP98共8個家族中的14個蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定指數(shù)介于32.19和42.58之間，平均值為39.64，總體上青蒿P450穩(wěn)定性不太好。脂溶性指數(shù)在89.75和102.11之間，平均值也高達96.37，而其親水性指數(shù)皆為負值，故青蒿P450都是親脂性蛋白質(zhì)。從表3可以看出，青蒿 P450中除 ADO16185.1(CYP92A)、ABC94480.1(CYP706)、ADO16181.1(CYP73A)外，其余都是分泌途徑中的蛋白質(zhì)。信號肽分析結(jié)果表明，除ADO16181.1(CYP73A)外，其余都含有跨膜區(qū)，為跨膜蛋白質(zhì)。

圖1 青蒿P450基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of P450 from A.annua

利用在線程序SOPMA進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果(表3)表明，本研究所涉及的P450家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主要構(gòu)成元件，平均所占比例達39.64%，其次是無規(guī)則卷曲、β-折疊和轉(zhuǎn)角，平均所占比例分別為28.48%、16.57%和8.28%。以編號為BAM68808.1的蛋白質(zhì)為例，繪制蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(圖3)。從圖3中可見，α-螺旋為主要構(gòu)成元件，無規(guī)則卷曲、β-折疊和轉(zhuǎn)角分散在整個蛋白質(zhì)中。

表3 青蒿P450家族蛋白質(zhì)的生物信息Table 3 The biological information of P450 protein from A.annua

利用ESPript在線程序?qū)η噍颬450進行同源比對和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)青蒿P450一級結(jié)構(gòu)同源性不高，但它們卻有著非常類似的二級結(jié)構(gòu)(圖3)。將這些序列與CYP2C5(1DT6)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖比對，發(fā)現(xiàn)有6個基質(zhì)識別位點(SRSs)，且所有基質(zhì)結(jié)合位點都分布在不同結(jié)構(gòu)元件中，識別特異的底物。所有青蒿P450都含有典型的保守結(jié)構(gòu)域: PERF結(jié)構(gòu)域(PxRx)、K螺旋(ExxR)、C末端的血紅素結(jié)合域(FxxGxxxCxG)以及N端的跨膜區(qū)(圖4)。血紅素結(jié)合域是P450蛋白的特征結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域中存在與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對保守的半胱氨酸殘基。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，青蒿中不同P450氨基酸序列間存在嚴格的保守基序，這些保守的基序通常分散于P450氨基酸序列中的5個區(qū)域，它們與血紅素結(jié)合區(qū)(FXXGXXXCXG)，共同組成保守的P450結(jié)構(gòu)中心［14］。

圖2 青蒿、擬南芥和水稻的P450系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree ofP450 from A.annua，Arabidopsis and rice

圖3 利用程序SOPMA進行青蒿P450蛋白質(zhì)(BAM68808.1)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of P450(BAM68808.1)from A.annua by SOPMA

圖4 利用程序ESPript進行青蒿P450蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of P450 from A.annua using ESPript

3 討論

P450 是生物界無處不在的超級大家族，植物P450 超家族被歸為10個基因簇，127個家族，其中水稻中有48個家族，擬南芥中有45個家族［21-22］，有9個家族是雙子葉植物擬南芥所特有的，10個家族是單子葉植物水稻所特有。本研究共鑒定了41個青蒿P450，分布在3個基因簇的11個家族中。有趣的是，作為雙子葉植物的青蒿，目前鑒定的僅有的11個家族中，既包括了擬南芥所特有的3個家族CYP82、CYP83和CYP716，又包括了水稻特有的1個家族CYP92。而Nelson等提到的菊科中出現(xiàn)的8個家族中［21］，只有CYP73和CYP81 2個家族出現(xiàn)。造成這種現(xiàn)象的原因，主要是由于擬南芥和水稻的基因組測序已經(jīng)完成，其P450的鑒定已趨于飽和，而菊科基因組的研究還遠遠落后于擬南芥和水稻，故還會有新的P450不斷補充。另一方面，也提示我們菊科植物作為一個古老的物種，有著更為豐富的P450家族蛋白質(zhì)有待開發(fā)、鑒定。

所有的P450蛋白質(zhì)都呈現(xiàn)相似的二級結(jié)構(gòu)，盡管它們的序列一致性不高(低于20%)［23］。為了更好地理解P450結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，我們以CYP2C5(1DT6)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖為模板［14］，對青蒿P450進行了氨基酸序列聯(lián)配和次級結(jié)構(gòu)元件的預(yù)測。發(fā)現(xiàn)所有的青蒿P450都含有典型的保守結(jié)構(gòu)域，包括PERF結(jié)構(gòu)域(PxRx)、K螺旋(ExxR)和C末端的血紅素結(jié)合域(FxxGxxxCxG)，另外某些氨基酸殘基也具有高度的保守性，這些保守結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的折疊、組裝中起著關(guān)鍵性作用［14］。而可變區(qū)主要出現(xiàn)在基質(zhì)結(jié)合區(qū)。P450是最大的酶家族之一，能催化多種底物，這就需要該蛋白質(zhì)能結(jié)合多種底物，行使各自的功能。

［1］ OMURA T，SATO R.A new cytochrome in liver microsomes［J］.J Biol Chem，1962，237:1375-1376.

［2］ ESTABROOK R W，COOPER D Y，ROSENTHAL O.The light reversible carbon monoxide inhibitionof the steroid C21-hydroxylase system of the adrenal cortex［J］.Biochem Z，1963，338: 741-755.

［3］ WERCK-REICHHART D，F(xiàn)EYEREISEN R.CytochromesP450: a success story［J］.Genome Biol，2000，1(6):30031-30039.

［4］ FU C，XIONG J，MIAO W.Genome-wide identification and characterization of cytochrome P450 monooxygenase genes in the ciliate Tetrahymena thermophila［J］.BMC Genomi，2009，10(208): 1-21.

［5］ BOSMAN A，MENDIS K N.A major transition in malaria treatment:theadoption and deployment of artemisinin-based combination therapies［J］.Am J Trop Med Hyg，2007，77:193-197.

［6］ MISRA A，CHANOTIYA C S，GUPTA M M，et al.Characterization of cytochrome P450 monooxygenases isolated fromtrichome enriched fraction of Artemisia annua L.leaf［J］.Gene，2012，510 (2):193-201.

［7］ KOMORI A，SUZUKI M，SEKI H，et al.Comparative functional analysis of CYP71AV1 natural variants reveals an important residue for the successive oxidation of amorpha-4，11-diene［J］.FEBS Lett，2013，587(3):278-284.

［8］ NELSON D R.Cytochrome P450 nomenclature，2004［J］.Methods Mol Biol，2006，320:1-10.

［9］ EDGAR R C.MUSCLE:a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity［J］.BMC Bioinf，2004，5:113-131

［10］HALL B G.Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA［J］.Mol Biol Evol，2013，30(5):1229-1235.

［11］EMANUELSSON O，NIELSEN H，BRUNAK S，et al.Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence［J］.J Mol Biol，2000，300:1005-1016.

［12］PETERSEN T N，BRUNAK S，VON HEIJNE G，et al.SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembraneregions［J］.Nature Methods，2011，8:785-786.

［13］LI L，CHANG Z，PAN Z，et al.Modes of heme binding and substrate access for cytochrome P450CYP74A revealed by crystal structures of allene oxide synthase［J］.PNAS，2008，105(37): 13883-13888.

［14］WILLIAMS P A，COSME J，SRIDHAR V，et al.Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase:structural adaptations formembrane binding and functional diversity［J］.Mol Cell，2000，5(1):121-131.

［15］GOUET P，ROBERT X，COURCELLE E.ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins［J］.Nucleic Acids Res，2003，31(13): 3320-3323.

［16］RO D K，PARADISE E M，OUELLET M，et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast［J］.Nature，2006，440(7086):940-943.

［17］TEOH K H，POLICHUK D R，REED D W，et al.Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1，a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin［J］.FEBS Lett，2006，580(5):1411-1416.

［18］OLSSON M E，OLOFSSON L M，LINDAHL A L，et al.Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L.［J］.Phytochemistry，2009，70(9):1123-1128.

［19］TING H M，WANG B，RYDEN A M，et al.The metabolite chemotype of Nicotianaben thamiana transiently expressing artemisinin biosynthetic pathway genes is a function ofCYP71AV1 type and relative gene dosage［J］.New Phytol，2013，199(2):352-366.

［20］NAIR P，MISRA A，SINGH A，et al.Differentially expressed genes during contrasting growth stages of Artemisia annua for artemisinincontent［J］. PLoS ONE， 2013， 8 (4): 6037510-6037512.

［21］NELSON D R，SCHULER M A，PAQUETTE S M，et al.Comparative genomics of rice and Arabidopsis.Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot［J］.Plant Physiol，2004，135(2):756-772.

［22］NELSON D R，WERCK-REICHHART D.A P450-centric view of plant evolution［J］.Plant J，2011，66(1):194-211.

［23］GRAHAM S E，PETERSON J A.How similar are P450s and what can their differences teach us?［J］.Arch Biochem Biophys，1999，369(1):24-29.