李秋萍 蔣俏麗 翟文文 戴俊東

姜黃素(Curcumin)是中藥姜黃Curcuma longa L．中的主要活性成分，具有抗炎［1-2］、抗氧化［3-4］、抗抑郁［5-6］、改善記憶力［7-8］、抑制腫瘤生長［9-10］、保肝等藥理作用［11-12］。大量臨床前［13-14］和臨床研究［15-16］表明姜黃素安全性較高，耐受水平可達(dá)12 g/天。姜黃素價格低廉、來源廣泛、療效可靠，可作為治療多種疾病的潛在開發(fā)藥物，但是姜黃素水溶性和穩(wěn)定性差、易被腸道和肝臟酶系統(tǒng)代謝，導(dǎo)致其口服血藥濃度低、體內(nèi)生物利用度差，大大限制了其臨床應(yīng)用［17］。胡椒堿(Piperine)作為胡椒科植物蓽茇Piper longum L．中的主要活性成分，可以從吸收、代謝等多種途徑提高藥物的生物利用度，與一些藥理作用好、吸收困難、容易代謝的藥物聯(lián)合應(yīng)用具有重要的臨床意義［18-19］。借助微粒粒徑小、黏膜親和性好的自微乳給藥系統(tǒng)(self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)聯(lián)合包載姜黃素和胡椒堿有望在顯著改善姜黃素溶解性的同時提高其體內(nèi)穩(wěn)定性，增加局部藥物濃度，有效增強(qiáng)對結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等結(jié)腸局部疾病的治療效果。

國內(nèi)外學(xué)者對姜黃素的穩(wěn)定性進(jìn)行了廣泛研究，主要涉及到光照、溫度、pH值、表面活性劑等對姜黃素穩(wěn)定性的影響，但對其在體外生物樣品中的穩(wěn)定性考察甚少，本研究通過HPLC測定姜黃素的含量，體外考察并比較姜黃素溶液、姜黃素—胡椒堿混合溶液及姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳溶液在人工結(jié)腸液及小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性，探討自微乳給藥系統(tǒng)及胡椒堿對姜黃素在結(jié)腸部位穩(wěn)定性的改善作用，為研制新型姜黃素－胡椒堿復(fù)方自微乳結(jié)腸靶向制劑的可行性提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級KM小鼠，雄性45只，體質(zhì)量35～38 g，由北京斯貝福實(shí)驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK京2011－0004。

1.2 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀(SPD－20A，日本島津);色譜柱(Purospher STAR LP C18，4.6 mm × 250 mm，5μm，德國默克);十萬分之一電子分析天平［BT125D，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司］;超級恒溫水浴器(501 A型，上海實(shí)驗儀器有限公司);點(diǎn)加熱磁力攪拌器(RT10 Power IKA?－WERKE，上海大邁儀器有限公司);高速組織勻漿機(jī)(IKA?T10，德國IKA集團(tuán));臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL－20M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

姜黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110823－201004);胡椒堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110775－201104);姜黃素(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號:20140324);胡椒堿(西安宜昌生物制品有限公司，批號:61003780);Capryol 90(法國嘉法賽公司，批號:144603);Transcutol HP(法國嘉法賽公司，批號:143339);Cremophor RH40(德國BASF公司，批號:87712168E0);乙腈、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司);水為純化水，其他試劑均為分析純。姜黃素－胡椒堿復(fù)方自微乳(自制)。

1.3 色譜條件

色譜柱:Purospher STAR LP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:乙腈－4%冰醋酸溶液(55∶45);流速:1 mL/min;紫外檢測波長:342 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL。姜黃素和胡椒堿的理論塔板數(shù)均大于4000。

1.4 樣品的制備

姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳:取聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremophor RH40)6.0 g;二乙二醇單乙基醚(Transcutol HP)3.0 g;丙二醇單辛酸酯(Capryol 90)1.0 g，精密稱定，置于 50 mL燒杯中，70℃、100 rmp/min磁力攪拌10分鐘，得空白自微乳，精密稱取空白乳1.0 g，加入姜黃素60.0 mg，胡椒堿1.0 mg，37℃、50 rmp/min磁力攪拌15分鐘使之完全溶解，得姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳。

姜黃素和胡椒堿對照品儲備液:取姜黃素對照品5.0 mg和胡椒堿對照品1.0 mg，精密稱定，分別置于10 mL和100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

姜黃素對照品溶液:精密量取姜黃素對照品儲備液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

姜黃素—胡椒堿混合對照品溶液:精密量取姜黃素和胡椒堿對照品儲備液各1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

姜黃素溶液:取姜黃素60.0 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

姜黃素—胡椒堿混合溶液:取姜黃素60.0 mg，胡椒堿1.0 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.5 不同介質(zhì)中姜黃素的結(jié)腸穩(wěn)定性

1.5.1 不同介質(zhì)中姜黃素在人工結(jié)腸液中的穩(wěn)定性 參照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄XIXD規(guī)定，選擇pH 7.8～8.0的磷酸鹽緩沖液作為人工結(jié)腸液。

1.5.2 不同介質(zhì)中姜黃素在人工結(jié)腸液中的穩(wěn)定性試驗 精密量取姜黃素溶液和姜黃素－胡椒堿混合溶液各2 mL;另外取姜黃素－胡椒堿復(fù)方自微乳0.25 g，精密稱定。分別置于50 mL棕色容量瓶中，加入(37±0.5)℃的人工結(jié)腸液稀釋至刻度，搖勻，置于(37±0.5)℃ 恒溫水浴中孵育，分別于0、2、3、4、6、8、12、24 小時取樣1 mL 于 5 mL 棕色容量瓶中，冰浴終止反應(yīng)，加入甲醇適量超聲處理10分鐘，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，立即取5μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積，計算藥物含量。

1.5.3 不同介質(zhì)中姜黃素在小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性 空白小鼠結(jié)腸勻漿液的制備:取KM小鼠禁食不禁水36小時，脫頸椎處死，剖開腹腔，取出整段結(jié)腸，沿腸系膜邊緣剖開腸腔，用預(yù)冷的pH 7.4磷酸鹽緩沖液將上述結(jié)腸反復(fù)沖洗干凈，用清潔濾紙吸干水分，準(zhǔn)確稱重后，立即用眼科剪剪碎，置于冰浴的組織勻漿器中，加入預(yù)冷的pH 7.4磷酸鹽緩沖液，按重量體積比為2∶8加勻漿介質(zhì)，冰浴條件下制備成20%的組織勻漿。將上述組織勻漿在4℃條件下12000 rmp/min離心15分鐘，取上清液作為空白小鼠結(jié)腸組織勻漿液。所有空白小鼠結(jié)腸組織勻漿液臨用前新鮮制備，所有實(shí)驗操作均應(yīng)在4℃以下條件進(jìn)行。

1.5.4 不同介質(zhì)中姜黃素在小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性試驗 精密量取姜黃素溶液和姜黃素－胡椒堿混合溶液各2 mL;另外取姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳0.25 g，精密稱定。分別置于25 mL棕色容量瓶中，加入(37±0.5)℃的小鼠結(jié)腸組織勻漿液稀釋至刻度，搖勻，置于(37±0.5)℃恒溫水浴中孵育，分別于 0、0.2、0.5、1、2、4、6、8 小時取樣1 mL于5 mL棕色容量瓶中，冰浴終止反應(yīng)，加入甲醇適量超聲處理10分鐘，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，4℃條件下3000 rmp/min離心15分鐘，平行處理3份，立即取5μL上清液，注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積，計算藥物含量。

1.6 統(tǒng)計分析

結(jié)果用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，實(shí)驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用單因素方差分析，LSD檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素在小鼠生物樣品中分析方法的建立

方法專屬性考察試驗結(jié)果表明，在前述液相條件下，小鼠結(jié)腸勻漿液中姜黃素的保留時間與姜黃素對照品保留時間基本一致，小鼠結(jié)腸勻漿液中內(nèi)源性物質(zhì)對姜黃素的檢測無干擾，方法專屬性良好，結(jié)果見圖1;以藥物濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得姜黃素在小鼠生物樣品中的得回歸方程為Y=7632.8X－33685，R2=0.999，線性范圍為9.88～197.6μg/mL，藥物濃度與峰面積線性關(guān)系均良好;小鼠生物樣品中姜黃素低、中、高3個濃度的提取回收率介于93～97%之間(見表1)，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD均小于2%，說明建立的分析方法符合生物樣品檢測要求。

2.2 不同介質(zhì)中姜黃素的結(jié)腸穩(wěn)定性

2.2.1 不同介質(zhì)中姜黃素在人工結(jié)腸液中的穩(wěn)定性 37℃人工結(jié)腸液中孵育24小時后，姜黃素溶液、姜黃素—胡椒堿混合溶液和姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳中姜黃素的降解百分率分別為19.93%、12.67%和10.50%，姜黃素—胡椒堿混合溶液組、姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳組與姜黃素溶液組相比均有極顯著性差異(P＜0.01)，降解趨勢見表2。三種不同介質(zhì)中姜黃素的降解均在12小時后基本保持穩(wěn)定，在12小時內(nèi)以lgC對時間t作圖為一直線，表明姜黃素的降解過程符合一級動力學(xué)方程，根據(jù)一級反應(yīng)的反應(yīng)速率方程及半衰期計算公式:

計算得姜黃素在姜黃素溶液、姜黃素—胡椒堿混合溶液和姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳中，經(jīng)37℃人工結(jié)腸液孵育后半衰期分別為19.67小時、57.87小時和75.23小時。

圖1 小鼠結(jié)腸勻漿液中姜黃素的HPLC圖

表1 提取回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.2.2 不同介質(zhì)中姜黃素在小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性 37℃小鼠結(jié)腸組織勻漿液中孵育8小時后，姜黃素溶液、姜黃素—胡椒堿混合溶液和姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳中姜黃素的降解百分率分別為19.96%、14.49% 和4.63%，姜黃素—胡椒堿混合溶液組、姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳組與姜黃素溶液組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，降解趨勢見表3。三種不同介質(zhì)中姜黃素的降解均在8小時后基本保持穩(wěn)定，但降解過程并不符合一級動力學(xué)方程。

表2 人工結(jié)腸液中不同介質(zhì)中各時間點(diǎn)姜黃素百分含量的比較±s，%，n=3)

表2 人工結(jié)腸液中不同介質(zhì)中各時間點(diǎn)姜黃素百分含量的比較±s，%，n=3)

注:與姜黃素溶液相比較a P＜0.05，b P＜0.01。

小時姜黃素溶液 100±0.31 91.88±1.04 98.17±0.70 85.25±1.24 8不同介質(zhì) 0小時 2小時 3小時 4小時 6小時 8小時 12小時 24 1.03±1.10 81.45±1.56 80.11±0.53 80.07±0.99姜黃素—胡椒堿混合溶液100±0.43 97.65±0.82b 96.89±0.95b 95.35±1.49b 93.17±1.31b 90.75±0.94b 88.02±0.98b 87.33±0.30b姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳100±0.99 98.48±0.89b 97.98±1.60b 96.96±0.76b 95.03±0.61b 92.81±0.89b 90.11±0.81b 89.50±0.75b

表3 結(jié)腸組織勻漿液中不同介質(zhì)中各時間點(diǎn)姜黃素百分含量的比較±s，%，n=3)

表3 結(jié)腸組織勻漿液中不同介質(zhì)中各時間點(diǎn)姜黃素百分含量的比較±s，%，n=3)

注:與姜黃素溶液相比較a P＜0.05，b P＜0.01。

小時姜黃素溶液 100±0.23 94.90±1.71 92.59±1.50 89.95±1.04 8不同介質(zhì) 0小時 0.2小時 0.5小時 1小時 2小時 4小時 6小時 8 5.38±0.87 81.90±0.79 81.03±0.58 80.04±1.02姜黃素—胡椒堿混合溶液100±0.34 96.98±0.74 95.52±0.78a 94.87±0.38b 93.23±0.91b 90.11±1.04b 87.22±0.50b 85.51±0.80b姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳100±0.19 98.96±0.43b 98.27±0.73b 97.56±1.20b 97.35±0.55b 96.55±0.93b 95.93±0.41b 95.37±0.26b

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗結(jié)果表明，姜黃素在人工結(jié)腸液及小鼠結(jié)腸組織勻漿液中穩(wěn)定性較差，當(dāng)加入胡椒堿后其穩(wěn)定性顯著增加，制備成姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳后姜黃素的穩(wěn)定性進(jìn)一步增加，說明復(fù)方自微乳可以顯著改善姜黃素在結(jié)腸部位的穩(wěn)定性，避免其在結(jié)腸部位的大量降解和代謝，增加姜黃素在結(jié)腸黏膜表面的滯留時間，其原因可能是胡椒堿對結(jié)腸部位酶系統(tǒng)的抑制作用及自微乳將姜黃素包載其中的保護(hù)作用。由此可知，姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳顯著改善了姜黃素在結(jié)腸部位的穩(wěn)定性。

大量研究表明［20-21］，胡椒堿可以通過增加膜流動性及改變酶動力學(xué)，抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白、藥物代謝酶CYP3A4和葡萄糖醛酸酶等途徑改善姜黃素的體內(nèi)吸收程度和穩(wěn)定性。Shoba等［22］給8名志愿者同時口服姜黃素和胡椒堿，45分鐘后姜黃素的生物利用度增加了2000%;當(dāng)給大鼠口服2 g/kg姜黃素的同時服用20 mg/kg胡椒堿1～2小時后，姜黃素的血清濃度增加了154%，表明胡椒堿作為肝臟和腸道葡萄糖醛酸酶抑制劑，可以顯著改善姜黃素在人體和大鼠體內(nèi)的吸收程度和穩(wěn)定性，從而提高姜黃素的體內(nèi)生物利用度。但筆者在制備復(fù)方自微乳過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入胡椒堿后，自微乳給藥系統(tǒng)中姜黃素的穩(wěn)定性有所增加，即胡椒堿的加入可以有效改善姜黃素的體外穩(wěn)定性，本實(shí)驗也證實(shí)了此結(jié)論，該結(jié)論國內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報道，可能與胡椒堿分子結(jié)構(gòu)中含有烯醇結(jié)構(gòu)和多個不飽和共軛雙鍵，具有較強(qiáng)的還原性有關(guān)。

pH值是影響姜黃素穩(wěn)定性的重要因素之一，研究表明姜黃素的降解呈pH依賴性，當(dāng)pH≤5時姜黃素穩(wěn)定，當(dāng)處于中性或堿性環(huán)境時，姜黃素就會快速降解［23］。韓剛等［24］將姜黃素置于磷酸鹽緩沖體系中孵育，結(jié)果表明pH=7時，t1/2=433.1小時，pH=8時，t1/2=52.8小時。因此，在對姜黃素進(jìn)行研究時，應(yīng)注意溶液pH值對其穩(wěn)定性的影響。人工結(jié)腸液中姜黃素的穩(wěn)定性主要受pH值的影響，而在小鼠結(jié)腸組織勻漿液中除受pH值的影響外還受腸道酶系統(tǒng)的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳在小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性要稍強(qiáng)于人工結(jié)腸液中，可能是由于人工結(jié)腸液的pH值稍高，破壞了自微乳的穩(wěn)定性，使得姜黃素泄露，加速其降解。

本實(shí)驗的目的是通過體外實(shí)驗近似模擬小鼠體內(nèi)結(jié)腸的真實(shí)環(huán)境，通過姜黃素在人工結(jié)腸液和小鼠結(jié)腸組織勻漿液中的穩(wěn)定性研究，探討姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳對姜黃素穩(wěn)定性的改善作用，為姜黃素—胡椒堿復(fù)方自微乳結(jié)腸靶向制劑的研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)。如何最大限度的保持腸道酶系統(tǒng)的活性對該實(shí)驗至關(guān)重要，因此所有空白小鼠結(jié)腸組織勻漿液臨用前必須新鮮制備，所有有關(guān)小鼠結(jié)腸勻漿液中穩(wěn)定性實(shí)驗操作均應(yīng)在4℃以下條件進(jìn)行。實(shí)驗過程中發(fā)現(xiàn)，姜黃素在小鼠結(jié)腸液中的降解在1小時內(nèi)較明顯，之后降解速率逐漸降低，可能與腸道酶系統(tǒng)的活性逐漸減弱有關(guān)。

目前，大量研究表明姜黃藥材中存在著姜黃素的天然穩(wěn)定劑［25-26］，提示采用姜黃素提取物制備姜黃素新型制劑，可提高制劑中姜黃素的體外穩(wěn)定性，但對其體內(nèi)穩(wěn)定性和藥效作用的影響還有待進(jìn)一步研究。

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