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        柴苓護肝顆粒的優(yōu)化工藝

        2015-03-26 08:31:10楊瑾莫國棟宋鳳蘭李嘉良曾維國林麗
        環(huán)球中醫(yī)藥 2015年12期
        關(guān)鍵詞:柴胡皂苷總皂苷測定方法

        楊瑾 莫國棟 宋鳳蘭 李嘉良 曾維國 林麗

        柴苓護肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材組成,具疏肝利膽,解酒瀉毒的功效,臨床用于酒精肝、脂肪肝、急慢性病毒性肝炎等的治療。方中柴胡疏肝解郁,使肝氣條達為君藥,現(xiàn)代藥理研究表明柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分,具有保肝、抗炎、抗病毒、解熱、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性作用[1-6]。干膏得率作為劑型選擇的參考指標,是確定顆粒劑藥物日服量、單服量及包裝規(guī)格的重要參數(shù)[7-9]。因此,本文以方中柴胡總皂苷與浸膏得率的綜合評分為評價指標,采用正交試驗優(yōu)選柴苓護肝顆粒水提醇沉工藝。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        紫外可見分光光度計[UV-1800島津儀器(蘇州)有限公司];十萬分之一電子天平(AUW220D SHIMADZU);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52C上海亞榮生化儀器廠);恒溫水浴鍋(B-220上海亞榮生化儀器廠);AS系列超聲波清洗機(AS20500A天津奧特賽恩斯儀器有限公司);AP-01P真空泵(AP-01P天津奧特賽恩斯儀器有限公司);濃縮鍋(06038湖南衡陽金一帆制藥設備實業(yè)有限公司);數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(10-2A上海滬越實驗儀器有限公司、滬越科學實驗儀器廠)。

        1.2 試藥

        柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材購于廣州致信藥業(yè)有限公司。

        柴胡皂苷d對照品(含量98%,中國藥品生物制品檢定所),無水葡萄糖對照品(批號:110833-200302,中國藥品生物制品檢定所);硅藻土、氨水、甲醇、對二甲氨基苯甲醛、乙醇、蒸餾水。

        2 方法

        2.1 干膏得率的測定方法

        參照2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)(附錄XA)浸出物測定法。各正交實驗中藥液濃縮或定容至100 mL,精密吸取正交試驗所得的藥液5 mL,分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿(設重量為W1)中,水浴揮干,殘渣于105℃干燥3小時,取出,置干燥器中冷卻30分鐘,迅速精密稱定總重量(重量為W2),通過公式1計算其干膏得率。

        2.2 總皂苷的含量測定方法的建立

        2.2.1 標準曲線制備 精密稱取柴胡皂苷d對照品10.68 mg,置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容,搖勻,得對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.5 mL置1 mL容量瓶中,稀釋成系列標準溶液。移取各溶液0.5 mL,另取0.5 mL甲醇作為空白,分別精密加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL搖勻,于70℃反應10分鐘,取出,放冷,加入磷酸6 mL,70℃反應30分鐘,取出,放冷,在波長300 nm至600 nm掃描,得最大吸收波長為544 nm。于544 nm波長處測定吸收度。以吸光度值(Y)為縱坐標,以柴胡皂苷d的濃度(X)為橫縱坐標,繪制標準曲線,計算得回歸方程:Y=0.7067X-0.0227(r=0.9998),表明柴胡皂苷 d 在0.1068~1.068 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖1。

        圖1 柴胡皂苷d標準曲線圖

        2.2.2 精密度考察 取同一柴胡皂苷d對照品溶液,按2.2.1項下顯色方法進行操作,于544 nm連續(xù)測定吸光度6次,吸光度的RSD值為0.19%,表明儀器的精密度良好,符合測定要求。見表1。

        表1 供試品的精密度試驗結(jié)果

        2.2.3 重現(xiàn)性考察 分別取相同的6份供試品溶液,按2.2.1項下顯色方法進行操作,進行測定,計算總皂苷含量,結(jié)果皂苷含量的RSD為1.1%,表明該方法的重現(xiàn)性較好。見表2。

        表2 供試品溶液的重現(xiàn)性試驗結(jié)果

        2.2.4 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液,按2.2.1項下顯色方法進行操作,室溫放置,分別于0、15、30、45、60、90、120 分鐘測定吸光度,計算相對標準偏差RSD為1.2%,表明樣品溶液在90分鐘內(nèi)穩(wěn)定。見表3。

        2.2.5 加樣回收考察 精密量取已知皂苷含量的樣品溶液2.5 mL,共9份,每份分別準確加入柴胡皂苷 d 對照品2.638 mg、5.278 mg、10.560 mg(每個濃度3份),定容至5 mL,按樣品測定項下方法操作,測定吸光度,皂苷的平均加樣回收率為100.9%,RSD為2.9%。見表4。

        表3 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

        表4 加樣回收率試驗結(jié)果

        2.2.6 樣品測定 精密量取樣品溶液5 mL,置蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,加入1.5 g硅藻土混合,研勻,全部轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,加入5%氨水甲醇溶液25 mL,浸泡30分鐘,超聲30分鐘,濾過,再用5%氨水甲醇15 mL清洗錐形瓶和漏斗,合并濾液,揮干,殘渣加甲醇溶解,定容至10 mL。再分別精密吸取2 mL至具塞試管中,加甲醇至5 mL。按2.2.1項下進行操作,測得其吸光度值,根據(jù)標準曲線求總皂苷的含量。

        2.3 水提工藝優(yōu)化

        2.3.1 因素水平的確定 在單因素考察的基礎上,根據(jù)處方中藥物性質(zhì)及實踐經(jīng)驗選擇藥材浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量為考察因素,對水提工藝的進行優(yōu)選,以確定最佳水提條件,為生產(chǎn)提供依據(jù)。各因素設3個水平,因素水平表見表5。2.3.2 樣品溶液的制備 處方:柴胡160 g、豬苓200 g、黨參 200 g、白術(shù) 133 g、澤瀉 160 g、姜半夏133 g、桂枝133 g、炙甘草80 g、葡萄糖粉適量。按以上處方配比稱取柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材共90 g,根據(jù)L9(34)正交試驗表安排進行藥材水提處理,加水浸泡煎煮,收集水提液,濃縮至100 mL,得9份樣品溶液,按上述干膏得率測定方法和總皂苷測定方法測定。

        表5 水提因素水平表

        2.4 醇沉工藝優(yōu)化

        2.4.1 因素水平的確定 根據(jù)藥物的特性并結(jié)合生產(chǎn)實際,醇沉工藝選取了對醇沉影響較大的醇沉濃度、醇沉時間及濃縮液相對密度(50℃測)3個因素進行考察,每個因素選擇了3個水平,選擇L9(34)正交試驗表進行實驗。見表6。

        表6 醇沉因素水平表

        2.4.2 樣品溶液的制備 按處方配比稱取柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草藥材810 g,按上述確定的水提工藝進行提取,提取液過濾,濃縮至900 mL,精確分為9份,每份100 mL,將各份溶液根據(jù)L9(34)正交實驗表安排進行濃縮及醇沉,抽濾,濾液減壓回收乙醇,再分別定容至100 mL。按上述干膏得率測定方法和總皂苷測定方法測定。

        3 結(jié)果

        3.1 水提工藝結(jié)果

        以上實驗結(jié)果表明,水提過程中影響提取效率的因素D(加水量)>A(浸泡時間)>B(煎煮時間)>C(煎煮次數(shù)),最佳水提工藝條件為A3B3C3D2,即藥材加10倍量水,浸泡3小時,提取3次,每次提取2小時。方差分析表明浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量對提取效率均沒有顯著性影響。煎煮次數(shù)對提取效率影響較小,為了縮短提取周期,節(jié)約能源,結(jié)合大生產(chǎn)實際,將最終工藝確定為A3B3C2D2,即加10倍量水,藥材浸泡3小時,提取2次,每次提取2小時。見表7、8。

        表7 水提正交試驗結(jié)果表

        表8 綜合評分方差分析

        表9 醇沉正交試驗結(jié)果表

        表10 方差分析表

        3.2 醇沉工藝結(jié)果

        從以上結(jié)果可知,醇沉過程中影響提取效率的因素C(濃縮液相對密度)>B(醇沉時間)>A(醇沉濃度),經(jīng)方差分析可知,濃縮液相對密度和醇沉時間對醇沉效果有顯著性影響,醇沉最佳工藝為A2B3C2,即提取液濃縮至相對密度為1.16~1.20,加乙醇使含醇量為50%,靜置36小時。見表9、10。

        3.3 驗證試驗結(jié)果

        為進一步驗證正交試驗結(jié)果的準確性,以確保提取工藝合理可行,按上述優(yōu)選水提及醇沉工藝,重復試驗3次。即按處方配比稱取藥材90 g,加10倍量水,浸泡3小時,煎煮2次,每次2小時,藥液濃縮至相對密度為1.16~1.20,放冷,加乙醇使藥液含醇量為50%,靜置36小時,取上清液濾過,濾液減壓回收乙醇至無乙醇味,濃縮液定容至100 mL,按上述干膏得率測定方法和總皂苷測定方法測定。由表11可知,采用此水提工藝干膏得率均值為16.70%,總皂苷均值為3.752 mg/mL,說明該水提工藝條件基本穩(wěn)定,具有可重現(xiàn)性。

        表11 提取工藝驗證試驗結(jié)果表

        4 討論

        柴胡作為傳統(tǒng)中藥,主歸肝膽經(jīng),具有解表退熱,疏肝解郁,升舉陽氣的功效,由柴胡組成的方劑治療肝病均有較好的臨床療效[10-11]。中藥傳統(tǒng)湯劑多以水煎煮提取,本試驗尊重柴苓護肝方的傳統(tǒng)水煎方式,以君藥柴胡的主要活性成分柴胡總皂苷及得膏率為評價指標,其中干膏得率權(quán)重系數(shù)0.4,總皂苷含量權(quán)重系數(shù)0.6,規(guī)定干膏得率最大值為40分,總皂苷含量最大值為60分,其余值對應比較,兩項相加得綜合評分,對柴苓護肝方的提取工藝條件進行了優(yōu)化,優(yōu)選的工藝簡單,活性成分的提取率高,為柴苓護肝顆粒的制備工藝研究奠定了基礎,并為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        豬苓多糖、黨參多糖等成分具有明顯的保肝作用,因此,總多糖含量也作為考察的指標,為日后建立其質(zhì)量標準做準備。但是目前總多糖含量測定數(shù)據(jù)不理想,所以課題組將總多糖含量的測定作為后期工藝優(yōu)化的重點。

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