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        養(yǎng)陰活胃合劑對慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜淋巴細胞瘤-2基因和三葉因子1表達的影響

        2015-03-26 08:31:08陳彥竹何小艷曾斌芳
        環(huán)球中醫(yī)藥 2015年12期
        關鍵詞:養(yǎng)陰合劑空白對照

        陳彥竹 何小艷 曾斌芳

        慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)為胃癌前變化的最初階段,國內(nèi)臨床報道中藥可以阻斷或逆轉(zhuǎn)胃癌的癌前病變[1]。CAG病因復雜,具有病程長、反復發(fā)作的特點。經(jīng)過多年臨床驗證總結(jié)出養(yǎng)陰活胃合劑方,可改善CAG患者臨床癥狀,能夠改善局部病理以及逆轉(zhuǎn)胃黏膜的病理狀態(tài),使病變胃黏膜趨于正常,對治療慢性萎縮性胃炎有良好效果[2],為了探討該方對CAG的作用機制,本研究團隊應用該方對動物模型進行了研究,觀察其對CAG大鼠胃黏膜細胞相關因子B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和三葉因子 1(trefoil factor 1,TFF1)基因表達的影響,并探討其可能的機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        清潔級成年雄性Wistar大鼠96只,體質(zhì)量150~200 g,標準顆粒飼料,均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(新)2003-0001]。

        1.2 藥物及給藥方法

        中藥養(yǎng)陰活胃合劑組成:阿魏、蘆根、白術、茯苓、雞內(nèi)金、莪術各15 g、海螵蛸30 g、旋覆花10 g、炙遠志、砂仁、炙甘草各6 g。由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供水煎劑。模型復制成功后除空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)、自由進食水外,模型組繼續(xù)施加上述造模因素,養(yǎng)陰活胃合劑高、中、低劑量組分別喂飼水煎劑2.22 g/(kg·d)、1.48 g/(kg·d)和 0.74 g/(kg·d),陽性藥物對照組予維酶素0.86 g/(kg·d)灌胃,共12周。

        1.3 主要試劑與儀器

        (今寧)維酶素片(湖北綠金子藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn),批號:120901);無水乙醇(天津市靜海縣大邱莊工業(yè)園區(qū)生產(chǎn),批號:20131106);水楊酸鈉(天津市化學試劑三廠生產(chǎn),批號:20070916);兔抗Bcl-2多抗IgG,免疫組化試劑盒為英國abcam公司產(chǎn)品;兔抗TFF1多抗IgG,免疫組化試劑盒為美國GeneTex公司產(chǎn)品。

        TD5AWS臺式離心機(長沙湘儀離心儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162(上海躍進醫(yī)用光學儀器廠)。

        1.4 模型制備

        將實驗大鼠隨機分為6組,即空白對照組,模型組,陽性藥物對照組,中藥高、中、低劑量組,每組16只。大鼠顆粒飼料適應性喂養(yǎng)1周后,空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)、自由進食水,其余5組將2 g水楊酸鈉加入100 mL的30%乙醇溶液中,給大鼠灌胃3 mL/d,灌胃前1小時禁食、禁水;再配合隔日進食不禁水法,直到12周造模結(jié)束。每組處死2只大鼠,觀察胃黏膜腸上皮化生和萎縮情況,以證實CAG造模成功。

        1.5 取材及標本處理

        末次給藥后禁食不禁水24小時,5%戊巴比妥麻醉大鼠,剖取全胃,沿胃大彎側(cè)剖胃腔,作大體觀察,以4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)取材,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下組織形態(tài)觀察。

        1.6 Bcl-2與TFF1免疫組化染色方法

        采用通用型二步法免疫組化法檢測。石蠟切片脫蠟至水洗;3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化氫酶,PBS液沖洗3次,蒸餾水洗3次;枸櫞酸鈉緩沖液修復抗原,PBS沖洗3次,蒸餾水洗3次;加入山羊血清封閉非特異性抗原;一抗按照適當比例稀釋滴入(以PBS代替一抗作為陰性對照),4℃冰箱孵育過夜,次日37℃下復溫30分鐘,PBS沖洗3次;滴加通用型二抗,37℃溫箱孵育25分鐘,PBS洗滌3次;DAB顯色3~5分鐘,蘇木素復染10秒,蒸餾水沖洗返藍;各級乙醇脫水;二甲苯透明,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察。各指標結(jié)果用標記指數(shù)(u)表示:LI:陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%。在高倍鏡下選取5個有代表性的視野,每個視野記數(shù)100個細胞,計算各指標陽性細胞表達率。

        1.7 統(tǒng)計學處理

        應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以均數(shù)±標準差±s)表示,采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析,經(jīng)檢驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊,組間比較采用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠胃組織肉眼觀察比較

        空白對照組大鼠胃黏膜柔軟,表面較多黏液,皺襞面光滑,胃壁彈性良好,呈橘紅色。模型組大鼠胃黏膜薄弱粗糙,灰白色澤,表面黏液減少,可見細小顆粒和結(jié)節(jié),亦可見黏膜糜爛出血,皺襞變細,胃壁彈性減低,養(yǎng)陰活胃合劑組及陽性藥維酶素組部分胃黏膜基本恢復正常,以養(yǎng)陰活胃合劑組為明顯。

        2.2 胃組織形態(tài)觀察比較

        空白對照組大鼠胃黏膜厚度正常,黏膜上皮層呈單層柱狀,上皮細胞及腺體排列整齊,大小形狀較為一致,固有層可見少許嗜酸性粒細胞散在,無增生和化生現(xiàn)象,肌層未見明顯變化。模型組胃黏膜固有層腺體均有不同程度減少,胃黏膜固有層變薄,黏膜下層充血、水腫,黏膜固有層下部局灶性淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤較明顯,可見黏膜肌層增厚,胃幽門部位腺體結(jié)構(gòu)不完整,腸上皮化生。陽性藥物對照組胃黏膜較薄,固有層腺體有輕度減少,淋巴細胞灶性浸潤。中藥高劑量組胃黏膜基本正常,腺體排列較規(guī)整,可見散在淋巴細胞灶性浸潤,未見腸上皮化生。見圖1。說明養(yǎng)陰活胃合劑與陽性藥物對照組均能改善胃黏膜的病理形態(tài),但以養(yǎng)陰活胃合劑效果為佳。

        2.3 各組大鼠胃黏膜Bcl-2免疫組化染色統(tǒng)計的比較

        Bcl-2蛋白陽性反應物質(zhì)呈棕黃色顆粒,主要位于細胞漿內(nèi)??瞻讓φ战M大鼠胃黏膜有極少量陽性細胞染色為細胞質(zhì)染色,細胞核有少量表達;陽性藥物對照組和中藥高、中劑量組大鼠胃黏膜部分細胞可見黃色、褐色程度不同的染色,與模型組比較染色較淺;模型組染色最重。見圖2。

        圖1 大鼠胃黏膜組織HE染色病理切片(HE×200)

        圖2 各組大鼠胃黏膜中Bcl-2蛋白的表達情況(×200)

        采用陽性著色細胞計數(shù)法,統(tǒng)計結(jié)果:與空白對照組比較,各組Bcl-2蛋白陽性表達率均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,中藥高、中劑量組和陽性藥物對照組Bcl-2蛋白陽性表達率均明顯降低(P<0.05);與陽性藥物對照組比較,中藥高劑量組Bcl-2蛋白陽性表達率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中藥高、中、低劑量組間比較,中藥低劑量組Bcl-2明顯高于中藥高、中劑量組(P<0.05)。見表1。

        2.4 各組大鼠胃黏膜TFF1免疫組化染色統(tǒng)計的比較

        TFF1主要表達于胃黏膜腺體細胞胞漿中,細胞膜及細胞核中有少量表達??瞻讓φ战M大鼠胃黏膜腺體細胞胞漿有大量陽性細胞表達,核周聚焦明顯,呈棕黃色,染色最深見于接近腔面的細胞;陽性藥物對照組和中藥組大鼠胃黏膜部分細胞可見黃色程度不等的染色,與模型組比較染色較重;模型組染色最輕。見圖3。

        表1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1陽性表達率的比較±s,表達率/%)

        表1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1陽性表達率的比較±s,表達率/%)

        注:與模型組比較,a P<0.05;與空白對照組比較,b P<0.05;與陽性藥物對照組比較,c P<0.05;與中藥低劑量組比較,d P<0.05。

        14 18.08 ±1.62 95.66 ±1.7陽性藥物對照組 13 37.45 ±2.69ab 89.40 ±2.45ab模型組 11 43.41 ±3.14b 84.00 ±2.79b中藥高劑量組 12 32.25 ±2.59abcd 93.33 ±4.18acd中藥中劑量組 12 34.90 ±3.28abd 90.90 ±5.76abd中藥低劑量組 13 40.54 ±7.03b 86.68 ±5.01陽性空白對照組組別 n Bcl-2陽性 TFF1 b

        圖3 各組大鼠胃黏膜中TFF1蛋白的表達情況(×200)

        采用陽性著色細胞計數(shù)法,統(tǒng)計結(jié)果:與空白對照組比較,除中藥高劑量組接近于空白對照組外(P>0.05),其余各組TFF1陽性表達率均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,中藥高、中劑量組和陽性藥物對照組TFF1蛋白陽性表達率均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與陽性藥物對照組比較,中藥高劑量組TFF1蛋白陽性表達率明顯升高(P<0.05);中藥高、中、低劑量組間比較,中藥低劑量組TFF1陽性表達率明顯低于中藥高、中劑量組(P <0.05)。見表1。

        3 討論

        CAG多由慢性淺表性胃炎演變而成,是導致胃癌發(fā)生的重要原因。其病情遷延反復難愈,兼于長期的病理損傷本身、內(nèi)傷外邪等諸多因素而導致血絡瘀阻。本實驗中養(yǎng)陰活胃合劑能夠改善大鼠腺體萎縮情況,使病變胃黏膜趨于正常,對CAG大鼠有良好治療作用。方中蘆根養(yǎng)陰和胃降逆,配伍白術、茯苓健脾助運,加之阿魏消積散痞,莪術可活血行氣止痛,旋復花、炙遠志兼顧疏肝理氣、化痰通絡,合雞內(nèi)金、砂仁消食和胃,諸藥配合,標本兼顧,共奏養(yǎng)陰活血,化痰和胃之功。

        臨床資料證實胃癌前狀態(tài)和胃癌組織中TFF1的表達明顯下調(diào),可能是胃黏膜惡變的早期事件之一[3]。TFF1作為三葉因子家族成員之一,具有保護胃腸道黏膜、促進細胞遷移和黏膜修復的重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),中藥組TFF1陽性表達率明顯高于其他各組,提示養(yǎng)陰活胃合劑可能通過增加胃黏膜TFF1表達而起到治療慢性萎縮性胃炎的作用,從而抑制腫瘤的產(chǎn)生。Bcl-2是Tsujimoro等人在1985年最先從濾泡性非霍奇金淋巴瘤中分離出來的一個抗凋亡基因。轉(zhuǎn)基因研究表明,Bcl-2為致癌基因,主要通過抑制線粒體依賴性凋亡通路被激活的功能達到抑制細胞凋亡和延長細胞壽命的作用造成腫瘤細胞堆積[4]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胃竇黏膜Bcl-2陽性表達明顯升高,經(jīng)養(yǎng)陰活胃合劑干預后,中藥高、中劑量組及陽性藥物對照組Bcl-2蛋白陽性表達均呈減少趨勢,表明養(yǎng)陰活胃合劑能不同程度地下調(diào)Bcl-2蛋白表達,可能在一定程度上促使胃黏膜上皮細胞細胞增殖和細胞凋亡平衡,改善甚至逆轉(zhuǎn)CAG胃黏膜的病理狀態(tài)。

        綜上所述,通過本研究提示養(yǎng)陰活胃合劑可明顯降低Bcl-2和增強TFF1的表達,通過保護胃黏膜細胞,阻止癌前病變進一步發(fā)展,促使病變胃黏膜恢復正常,起到改善甚至逆轉(zhuǎn)CAG病變的作用。

        [1] 王文,張仲海,夏天.消萎靈對大鼠胃黏膜癌前病變的逆轉(zhuǎn)作用[J].新中醫(yī),1999,31(7):39-40.

        [2] 戴明,丁國寧,雷云霞,等.養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎患者胃鏡組織學影響[J].陜西中醫(yī),2013,7(9):34.

        [3] 石淑青,蔡建庭.三葉因子Ⅰ和Ⅱ在胃癌和癌前狀態(tài)中的表達[J].中華內(nèi)科雜志,2004,43(3):195-198.

        [4] Mariano M T,Moritti I,Donelli A,et al.Bcl-2 gene expression in hemato poietic cell differentiation[J].Blood,1997,80:768-775.

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