郝薔薇 麻春杰 烏蘭其其格 曾寒泊 萬宇 田海廣

正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞可調(diào)節(jié)血管緊張度，維持血管結(jié)構(gòu)，并可分泌抗凝、抗血小板物質(zhì)和纖溶蛋白，防止炎癥細(xì)胞向血管壁黏附聚集［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多種因子，是檢測動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊易損的重要指標(biāo)。血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)和內(nèi)皮素(endothelin，ET)是反映血管內(nèi)皮功能的主要標(biāo)志物。前期研究表明，額爾敦—烏日勒能夠有效干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［2-3］，促進(jìn)eNOS基因的表達(dá)，增加其活性，升高內(nèi)皮細(xì)胞生成的一氧化氮水平［4-5］，但額爾敦—烏日勒穩(wěn)定AS家兔易損斑塊的作用機(jī)制與其對血管內(nèi)皮因子PAF、ET的影響具有怎樣的聯(lián)系，國內(nèi)外尚未有報(bào)道，故筆者團(tuán)隊(duì)對此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物

50只健康雄性新西蘭家兔［由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供，許可證號(hào):SCXK(京)2011-0006］。額爾敦—烏日勒(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào):120706;規(guī)格2 g/10粒);辛伐他汀(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào):20120703，國藥準(zhǔn)字 H20083840，規(guī)格20 mg/片);青霉素鈉注射液(華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020655，生產(chǎn)批號(hào):20120716，規(guī)格160萬單位/瓶×50瓶/盒);肝素鈉注射液(天津生化藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12020505，生產(chǎn)批號(hào):20121007，規(guī)格 1．25 萬單位/2 mL，2 mL/支，2 mL ×10 支/盒)。

1．2 試劑與儀器

PAF、ET的Elisa試劑盒由上海西塘生物科技有限公司提供(生產(chǎn)批號(hào)分別為F20412、F20030);PAF、ET-1一抗、二抗均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供(一抗生產(chǎn)批號(hào):bs-1119R，bs-0954R，二抗生產(chǎn)批號(hào):SP-0023)。Thermo酶標(biāo)儀(美國，型號(hào):Multiskan Ascent)，DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(中國金壇，型號(hào):DK-8D)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(中國蘇州，型號(hào):DNP9272)，高壓滅菌鍋(中國上海，型號(hào):YXQLS-75SII)，生物顯微鏡和成像系統(tǒng)(中國南京，型號(hào):BM2000型)，石蠟包埋機(jī)(德國，型號(hào):EG1150H+C)，高速立式離心機(jī)(日本，型號(hào):CF16RXii)

1．3 造模及分組

普通飼料喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為正常組10只，造模組40只。造模組高脂飼料喂養(yǎng)4周，實(shí)驗(yàn)第2周給造模組的家兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白生理鹽水溶液，4周后對造模的家兔進(jìn)行球囊拉傷手術(shù)［6］。于實(shí)驗(yàn)第8周通過檢測家兔血脂水平和主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)確定AS易損斑塊形成，證實(shí)造模成功，并將造模組最終存活的家兔(n=29)完全隨機(jī)分組，分為模型組(n=10)、額爾敦—烏日勒組(n=10)和辛伐他汀組(n=9)。

1．4 給藥方法及標(biāo)本制備

正常組和模型組均灌服等容積的蒸餾水;額爾敦—烏日勒組按家兔體質(zhì)量給予額爾敦—烏日勒0．4 g/(kg·d);辛伐他汀組按家兔體質(zhì)量給予辛伐他汀5 mg/(kg·d)，各藥分別用蒸餾水制成混懸液喂飼。1次/天，至24周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。第24周末心臟采血，3000 rmp離心10分鐘分離血清;同時(shí)，隨機(jī)空氣栓塞處死每組家兔，迅速取出主動(dòng)脈，生理鹽水清洗后，中性緩沖福爾馬林溶液固定。

1．5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

1．5．1 家兔血清 ET、PAF含量檢測 PAF、ET測定均采用酶聯(lián)免疫吸附(雙抗體夾心)法，根據(jù)試劑盒提供的試劑與實(shí)驗(yàn)步驟要求進(jìn)行操作，用Multiskan Ascent酶標(biāo)儀完成測定。

1．5．2 家兔主動(dòng)脈ET、PAF的表達(dá) 按照試劑說明書上步驟采用ABC法檢測，兩抗體均用抗體稀釋液稀釋200倍后使用，光鏡下觀測家兔主動(dòng)脈血管內(nèi)皮因子PAF、ET-1的表達(dá)。采用圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色切片半定量分析，每組隨機(jī)選取兩張切片，每張標(biāo)本400倍鏡下選取5個(gè)不重復(fù)的視野，測量其陽性染色部位的平均光密度值(average optical density，AOD)，作為每張標(biāo)本的的陽性定量指標(biāo)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，若符合正態(tài)性分布和方差齊性，則采用單因素方差分析，兩組間的比較采用LSD檢驗(yàn);若不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05或P＜0．01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組家兔血清ET、PAF濃度

家兔血清ET符合正態(tài)分布，但方差不齊，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)分析顯示，模型組家兔血清ET水平較正常組明顯升高(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較，額爾敦—烏日勒能明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔ET水平(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)家兔血清PAF數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)分析顯示，與正常組相比，模型組PAF濃度顯著升高(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，額爾敦—烏日勒能顯著降低血清PAF的濃度(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組家兔血清ET、PAF濃度的比較±s)

表1 各組家兔血清ET、PAF濃度的比較±s)

注:與正常組相比，a P＜0．01;與模型組相比，b P＜0．01;與辛伐他汀組比較，c P ＜0．01

分組 n ET(μg/L) PAFμg/mL)正常組9 158．55 ±16．64 23．58 ±1．48 10 117．02 ±16．69 19．17 ±2．13模型組 10 168．00 ±27．71a 29．33 ±3．89c額爾敦—烏日勒組 10 125．01 ±10．84bc 22．22 ±1．80b辛伐他汀組

2．2 各組家兔主動(dòng)脈ET、PAF的表達(dá)

光鏡下可見主動(dòng)脈血管ET、PAF胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒信號(hào)增強(qiáng)為陽性表現(xiàn)。光鏡下可見，ET在正常組血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)不明顯，模型組、額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組表達(dá)增強(qiáng)，呈棕黃色，與正常對照相比，模型組棕黃色顆粒表達(dá)強(qiáng)烈。免疫組化染色半定量分析染色切片中ET的AOD值符合正態(tài)性，方差齊，采用單因素方差及LSD比較。結(jié)果顯示，模型組家兔主動(dòng)脈ET的AOD值比正常組明顯升高(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比，額爾敦—烏日勒組ET的AOD值顯著降低(P＜0．01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與辛伐他汀組相比，額爾敦—烏日勒組ET的AOD值顯著降低(P＜0．05)，額爾敦—烏日勒組在降低主動(dòng)脈血管內(nèi)皮ET的表達(dá)上具有一定的優(yōu)勢。見表2、圖1。

光鏡下觀測PAF染色切片結(jié)果顯示，與正常對照相比，模型組有強(qiáng)烈的棕黃色顆粒表達(dá)，陽性部位在內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿、胞膜及胞質(zhì)里均可見。額爾敦—烏日勒組及辛伐他汀組兩組PAF陽性表達(dá)主要位于胞漿，胞膜僅有少量表達(dá)。染色切片中PAF的AOD值符合正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析及LSD比較。與正常組相比，模型組家兔主動(dòng)脈血管PAF的AOD值與正常組相較明顯升高，(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組相比，額爾敦—烏日勒組主動(dòng)脈PAF的AOD值顯著降低(P＜0．01)，差異具有顯著性。見表2、圖2。

表2 各組家兔主動(dòng)脈ET、PAF免疫組化染色AOD值的比較(±s)

表2 各組家兔主動(dòng)脈ET、PAF免疫組化染色AOD值的比較(±s)

注:與正常組相比，a P＜0．01;與模型組相比，b P＜0．01;與辛伐他汀組相比，c P ＜0．05。

10 0．0811 ±0．0138 0．0851 ±0．0021模型組 10 0．1605 ±0．0119a 0．1901 ±0．1735a額爾敦—烏日勒組 10 0．1060 ±0．0140bc 0．1327 ±0．0112b辛伐他汀組ET PAF正常組分組 n 9 0．1219 ±0．0158 0．1267 ±0．0138

圖1 各組家兔主動(dòng)脈ET免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖2 各組家兔主動(dòng)脈PAF免疫組化檢測結(jié)果(×400)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞具有抗凝、止血、選擇性屏障、細(xì)胞通透性等作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可使血液中的脂質(zhì)等成分堆積于內(nèi)皮下間隙，從而形成泡沫細(xì)胞［7］。血管內(nèi)皮功能減退是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變最敏感的指標(biāo)，是AS的重要始動(dòng)因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是誘發(fā)AS的重要環(huán)節(jié)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞可有效防止AS的發(fā)生發(fā)展。ET是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的主要縮血管因子，維持血管張力，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，而 PAF是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵起始因子［8］。

隨著民族醫(yī)藥的發(fā)展，蒙醫(yī)蒙藥在臨床上取得了良好療效，并具有安全、高效、低毒等優(yōu)勢。AS易損斑塊的檢測手段多具有損傷性，目前常采用復(fù)合因素造模建造雄性家兔AS易損斑塊模型，實(shí)驗(yàn)8周末通過檢測血脂，顯示家兔已形成AS易損斑塊，為進(jìn)一步觀察蒙藥額爾敦—烏日勒對AS易損斑塊血清及主動(dòng)脈ET、PAF的干預(yù)作用奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明額爾敦—烏日勒能降低AS家兔血清及主動(dòng)脈ET、PAF水平(P＜0．01)，并且與辛伐他汀組相比，在影響AS易損斑塊家兔主動(dòng)脈ET水平上具有一定的優(yōu)勢(P＜0．05)，為臨床尋找他汀類藥物的替代治療提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為臨床運(yùn)用中蒙藥治療AS提供更加完善的實(shí)驗(yàn)理論和依據(jù)。

總之，額爾敦—烏日勒可能通過降低血管內(nèi)皮因子ET、PAF的上升水平，降低主動(dòng)脈組織ET的表達(dá)，恢復(fù)內(nèi)皮功能的平衡狀態(tài)，從而發(fā)揮穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的作用。

［1］ 李丹，李玉潔，楊慶，等．血管內(nèi)皮功能障礙與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(8):272-276．

［2］ 麻春杰，董平，都格爾，等．額爾敦—烏日勒在家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊消退中的作用及其對炎癥因子的影響［J］．世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13(5):894-898．

［3］ 董平，麻春杰，溫都蘇，等．額爾敦—烏日勒對實(shí)驗(yàn)性家兔動(dòng)脈粥樣硬化的影響［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(5):1012-1015．

［4］ 烏蘭其其格，麻春杰，董平，等．額爾敦—烏日勒對AS家兔血清NO含量及主動(dòng)脈eNOS基因表達(dá)的影響［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33(3):603-605．

［5］ 董平．珍寶丸抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)制研究［D］．呼和浩特:內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，2011．

［6］ 都格爾．額爾敦—烏日勒及其優(yōu)化方對動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊家兔模型的干預(yù)作用［D］．北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014．

［7］ 邱雅慧．血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及損傷修復(fù)與動(dòng)脈粥樣硬化［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(10):1927-1929．

［8］ Tokumu ra A，Sum ida T，Tou jim a M，et al．Platelet-activating factor(PAF)-like oxidized phospholipids:relevance to atherosclerosis［J］．Biofactors，2000，13(1-4):29-33．