張文艷，孫寶飛，余資江＊＊＊，余彥，肖朝倫，羅時鵬，令狐艷，楊丹

(1.貴陽醫(yī)學院解剖學教研室，貴州貴陽550004;2.貴陽醫(yī)學院附院呼吸內科，貴州貴陽550004)

松樹皮提取物中含有大量原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)的化合物，OPCs具有抗炎、抗氧化及抗血小板聚集及改善學習記憶能力作用［1-3］。海馬內核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在腦缺血后可被誘導激活，NF-κB通過調控多種基因的表達參與了多種細胞因子和炎癥介質的轉錄調節(jié)，在缺血性腦損傷中具有重要作用。NF-κB作為腦缺血損傷的治療靶點，對有效防治腦缺血炎癥具有重要的理論和臨床意義［4］。目前中藥在治療腦缺血炎癥方面雖已有許多報道，但中藥作用于NF-κB信號轉導途徑的研究還較少。本實驗采用OPCs治療缺血再灌注模型小鼠，探討OPCs對缺血再灌注損傷后小鼠腦海馬神經元的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年昆明種小白鼠120只，體重20～22 g，由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK(黔)2002-0001。按隨機分組原則將120只小鼠分為正常對照組、假手術組、14 d模型組、14 d治療組、28 d模型組和28 d治療組，每組20只。飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，濕度48%～60%。

1.2 動物模型建立

各組小鼠常規(guī)飲食，術前12 h禁食，4 h禁水。小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，自下頜骨到胸骨柄間作5～8 mm長的頸部正中切口，游離雙側頸總動脈及伴行神經，夾閉雙側頸總動脈，缺血15 min，然后松開微動脈夾，恢復血液灌注15 min，反復3次造成小鼠腦缺血再灌注損傷，蘇醒前小鼠保溫。術后連續(xù)3 d給予青霉素2 000 000 U肌注抗炎，分籠飼養(yǎng)。假手術組除不夾閉頸總動脈外，其余操作同模型組。治療組在處死前7 d給予OPCs(100 mg/kg)灌胃治療，1次/d，正常對照組、假手術組、模型組灌注等量生理鹽水。

1.3 海馬組織炎癥因子測定

每組取10只小鼠海馬組織勻漿離心后取上清液，采用ELISA法測定腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)以及白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白表達

Western blot法檢測，每組各取10只小鼠斷頸處死取出全腦分離出海馬，切取雙側海馬CA3區(qū)組織，稱重，以1∶10加入4℃預冷的勻漿緩沖液后抽提核蛋白，恒溫冷凍離心機4℃，14 000 r/min離心30 min，收集上清液，Bradford法測定蛋白含量，加等體積的2×電泳樣品緩沖液混合，以1 g/L蛋白量上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后電轉膜至硝酸纖維膜，膜片以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(NF-κBp65單克隆抗體)4℃過夜，洗滌后與二抗-辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)物反應，強化學發(fā)光試劑(ECL)顯色劑顯色，以柯達醫(yī)學專用膠片曝光，手工顯影、定影、洗片，顯現(xiàn)特定的蛋白信號條帶。BIO-RAD生物圖像處理系統(tǒng)(PDQUEST 6.1.1)進行灰度測定。按目的蛋白灰度值與相應β-actin灰度值計算每例標本相應指標的相對值。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據用SPSS 11.5軟件處理，數(shù)據結果用均數(shù)±標準差(±s)表示，數(shù)據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

造模后觀察到模型組小鼠出現(xiàn)驚厥、呼吸深慢、心跳加快等腦缺血模型特異性表現(xiàn)。表明造模成功。

2.2 海馬組織中NF-α、IL-6蛋白表達

ELISA結果顯示，假手術組與正常對照組結果無差異(P＞0.05)，各模型組小鼠TNF-α、IL-6蛋白表達水平明顯高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);模型組中，14 d組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學(P＜0.05)，各治療組TNF-α、IL-6水平低于同期模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 海馬組織CA3區(qū)NF-κB蛋白表達

假手術組海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各模型組NF-κB蛋白水平顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各治療組低于同期模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1 各組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表達Tab.1 The protein expressions of TNF-α，IL-6 and NF-κB in hippocampal tissues of mice in each group

圖1 各組小鼠海馬組織CA3區(qū)NF-κB蛋白表達(Western blot)Fig.1 Expressions of NF-κB in CA3 region in hippocampal tissues of mice in each group

3 討論

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)引起缺血組織一系列復雜的病理生理變化，涉及自由基產生、氧化應激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎性細胞因子損害和細胞凋亡等多個方面。NF-κB是一類具有多向調節(jié)作用的核蛋白因子，當中樞神經系統(tǒng)缺血時，可被特異性激活，從而調控多種基因的表達，參與免疫、炎癥、氧化應激、細胞凋亡等多種病理生理過程，與缺血再灌注損傷關系密切［5］。NF-κB存在于腦血管內皮細胞、神經元和神經膠質細胞中，是由p50和p65兩個亞單位組成的異二聚體。NF-κB未激活時與抑制蛋白IκB結合后位于胞質，在某些刺激因素作用下IκB降解，并與NF-κB解離后被激活，進入胞核與特定基因啟動子結合，調控基因的轉錄［6］。多種炎癥遞質基因的啟動子和增強子中包含κB位點，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-12、血管細胞黏附分子-1、干擾素-γ等，這些因子促進炎癥反應，最終促使神經細胞從早期缺血到細胞死亡的不可逆損害演變，加重腦損傷，炎性細胞因子在缺血再灌注后所引發(fā)的繼發(fā)性損傷起關鍵作用［6］。

腦缺血早期TNF-α分泌的增加是缺血再灌注損傷形成的主要原因［7］，TNF-α又可誘導IL-6的合成。本研究證實腦缺血后NF-κB蛋白表達水平明顯升高，14 d模型組高于28 d模型組，可能與機體自身修復有關，提示NF-κB是腦缺血再灌注損傷炎癥機制中的一個關鍵性因子，在腦缺血中發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-6蛋白表達水平明顯升高，提示腦缺血再灌注后損傷機制可能與此有關。

從松樹皮中提取的OPCs是一種多酚類復合物，含量一般為80%左右，OPCs通過抗氧化、抗凋亡等途徑發(fā)揮改善腦缺血再灌注損傷的作用［8-11］。李建玲等［12］研究發(fā)現(xiàn)，OPCs可以通過下調凋亡相關蛋白caspase-3對腦缺血產生保護作用。楊東斌［13］發(fā)現(xiàn)OPCs能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷，IL-6和內皮素-1可能與其減輕炎癥反應有關。本研究采用OPCs治療腦缺血再灌注損傷小鼠后，蛋白印跡結果顯示海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白水平與同期模型組比較均降低，炎性因子TNF-α和IL-6水平均較同期模型組小鼠低，說明OPCs治療對核因子NF-κB的表達具有明顯的抑制作用，對小鼠缺血再灌注產生了一定的保護作用。提示如能通過某些方法、途徑或藥物來抑制NF-κB的激活，可有效地預防和治療腦缺血再灌注損傷。抗NF-κB產生可能為預防和治療腦缺血再灌注損傷提供一個新的思路和途徑。

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［13］楊東斌，原花青素對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織中TL-6和ET-1的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2013(9):44-45.