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        小鼠腸缺血再灌注誘發(fā)多器官功能障礙的動物模型研究**

        2015-03-26 11:19:58鄭德義王毅杜嬌李平洋肖向陽程代薇李自力
        關(guān)鍵詞:器官生存率分組

        鄭德義,王毅,杜嬌,李平洋,肖向陽,程代薇,李自力

        (貴州省人民醫(yī)院燒傷整形科,貴州貴陽550002)

        腸道缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion,II/R)損傷是嚴(yán)重創(chuàng)(燒)傷后常見的病理生理過程,腸缺血再灌注不僅引起腸損傷,而且導(dǎo)致機(jī)體其他器官如肺、肝及腎臟等多器官損害[1],發(fā)生多器官功能障礙綜合征(MODS),甚至多器官衰竭死亡。國內(nèi)文獻(xiàn)多以大鼠、兔等較大型嚙齒動物為實驗對象[2-3],且腸缺血及再灌注時間不一,本研究以小鼠對實驗對象,探索建立穩(wěn)定的II/R誘發(fā)MODS實驗動物模型。

        1 材料與方法

        1.1 動物分組

        10周齡健康雄性C57BL/6小鼠72只,體重22~26 g,根據(jù)觀察指標(biāo)隨機(jī)分組。分組1:腸缺血30 min組、40 min組、50 min組和60 min組,每組12只,手術(shù)后7 d時觀察腸缺血不同時間小鼠的生存率。分組2:假手術(shù)組(Sham,6只小鼠),腸缺血40 min后再灌注組(II/R,18只小鼠),分別于再灌注1 h、6 h和12 h(各6只)時取標(biāo)本。實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

        1.2 方法

        參照文獻(xiàn)[4]實驗,所有小鼠術(shù)前禁食12 h,自由飲水,腹腔注入1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉,開腹鈍性分離腸系膜前動脈,用動脈夾夾閉腸系膜前動脈(SMA)造成小鼠腸缺血,缺血相應(yīng)時間后松開動脈夾恢復(fù)血流再灌注,關(guān)閉腹腔;假手術(shù)組不夾閉SMA(僅開腹后關(guān)閉腹腔)。術(shù)后立即腹壁皮下注入生理鹽水1 mL,自由進(jìn)飲食。

        1.3 檢測指標(biāo)

        觀察分組1中的48只小鼠7 d內(nèi)的生存率,分組2中的24只小鼠分別于相應(yīng)時間,心臟穿刺抽血,室溫靜置、離心(4 000 g/min)15 min分離血清,-80℃保存,統(tǒng)一檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Crea)、乳酸脫氫酶(LDH)水平;腸缺血再灌注后6 h取右上肺葉、肝及腎臟組織做病理學(xué)檢查。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 II/R小鼠生存率

        觀察腸缺血再灌注后7 d內(nèi)動物生存狀況,隨著腸缺血時間延長,小鼠生存率明顯降低。在觀察期內(nèi),腸缺血30 min小鼠全部存活,缺血40 min動物生存率60%,缺血50 min小鼠生存率僅50%(在82 h半數(shù)動物死亡),腸缺血60 min小鼠生存率<40%(在6 h時半數(shù)動物死亡)。與腸缺血30 min比較,腸缺血50 min和60 min組小鼠死亡率明顯增加(P<0.05),見圖1。

        圖1 不同腸缺血時間小鼠的生存率Fig.1 Mice survival rate in differentischemia time groups

        2.2 血清ALT、AST、Crea和LDH

        小鼠腸缺血再灌注1 h時,僅有Crea指標(biāo)高于假手術(shù)組(P<0.01),腸缺血后再灌注6 h,4項血清學(xué)指標(biāo)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);而在12 h血清指標(biāo)中僅有ALT及AST明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)果提示,小鼠腸缺血再灌注損傷所引起的MODS在手術(shù)后6 h是最為顯著,是最佳時間點。見表1。

        2.3 肺、肝和腎組織改變

        假手術(shù)組小鼠肺、肝臟及腎臟組織形態(tài)正常。II/R后6 h肺、肝臟及腎臟發(fā)生病理改變,主要肺組織充血,肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤;肝細(xì)胞水樣變性、氣球樣變性,部分有炎性細(xì)胞浸潤;腎小管上皮細(xì)胞水腫(圖2)。

        表1 腸缺血后不同再灌注時間血清生化指標(biāo)變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

        表1 腸缺血后不同再灌注時間血清生化指標(biāo)變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

        (1)與sham比較,P<0.01

        再灌注時間1 h 6 h 12 h ALT(u/L)40.25±2.63 56±20.07 179.5±141.59(1)128.33±89.67(1)生化指標(biāo)sham 1910.33±369.85 AST(u/L)195.75±57.53 156.67±22.37 483.33±176.31(1)365±117.29(1)Crea(mmol/L)5.25±0.96 17.67±12.58(1)10.33±1.86(1)8.00±2.65 LDH(u/L)1496.75±382.85 1406.33±1136.55 3119±947.58(1)

        圖2 各組小鼠肺、肝和腎組織學(xué)表現(xiàn)(HE,×100)Fig.2 The pathological change of lung,liver and kidney induced by II/R

        3 討論

        腸缺血再灌注是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷體克后救治過程中可能發(fā)生的一個共同的病理生理階段。腸缺血再灌注損傷后腸黏膜屏障受損及功能下降、促使腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位,氧自由基損害、中性粒細(xì)胞活化和各種炎性細(xì)胞因子的過度合成及釋放,誘發(fā)全身炎性反應(yīng),導(dǎo)致肺、肝、腎臟等遠(yuǎn)隔臟器的損害[1],是ARDS和MODS發(fā)生的重要原因[5-6]。研究II/R損傷的發(fā)病機(jī)制,首先建立穩(wěn)定、可靠的實驗動物模型是關(guān)鍵。

        本實驗表明,隨著腸缺血時間增加,動物存活率逐漸降低,腸缺血60 min組小鼠,再灌注6 h時半數(shù)動物死亡,顯然不適合作為研究模型。腸缺血時間40~50 min小鼠在1周觀察期內(nèi),半數(shù)以上存活,是較為理想的腸缺血時間。因此,選擇腸缺血40 min后再灌注1 h、6 h及12 h時,觀察肝、腎及全身組織器官功能損傷情況及血清AST、ALT、LDH及Crea水平。LDH幾乎存在于所有器官組織細(xì)胞內(nèi),是有機(jī)體能量代謝過程中參與糖酵解的重要酶,當(dāng)組織器官發(fā)生病變時,細(xì)胞膜通透性增加,釋放更多的LDH到細(xì)胞間隙和體液,LDH水平是反應(yīng)細(xì)胞膜損傷較靈敏的指標(biāo)之一,是目前比較公認(rèn)測定細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠腸缺血再灌注1 h時血清學(xué)指標(biāo)僅有Crea高于假手術(shù)組,提示此時再灌注造成的損傷并不明顯;12 h時血清學(xué)指標(biāo)僅有ALT和AST高于假手術(shù)組,提示再灌注12 h時組織器官的修復(fù)功能可能部分恢復(fù);再灌注6 h時血清學(xué)4項指標(biāo)明顯高于假手術(shù)組,而且病理檢查提示,腸缺血后再灌注6 h,肺、肝臟及腎臟發(fā)生改變,主要表現(xiàn)組織細(xì)胞水腫、變性,伴隨炎癥細(xì)胞浸潤,提示小鼠缺血再灌注6 h是觀察MODS模型的最佳時間點。模型制作過程中,因小鼠體形小,要求手術(shù)操作熟練、輕柔、精細(xì),減少腹腔臟器的翻動,術(shù)中、術(shù)后注意保溫,缺血期間斷縫合或蚊式鉗夾閉暫時關(guān)閉腹腔,以防腸組織及腹腔體液外滲。

        綜上所述,應(yīng)用阻斷小鼠腸系膜上動脈40~50 mim再灌注6 h,既能保證動物生存率,滿足實驗要求,又能形成腸道及遠(yuǎn)隔器官損傷及功能障礙,為進(jìn)一步研究腸缺血再灌注誘發(fā)MODS發(fā)病機(jī)制的提供依據(jù)。

        [1]Harward TR,Brooks DL,F(xiàn)lynn TC,et al.Multiple organ dysfunction after mesenteric artery revascularization[J].J Vasc Surg,1993(18):459-469.

        [2]朱枝祥,陳丁丁.腸系膜動脈缺血再灌注誘發(fā)多器官功能障礙綜合征模型研究[J].抗感染藥學(xué),2010(2):93-96.

        [3]宋富波,楊牟,車海杰.兔急性腸道缺血再灌注損傷模型的建立[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010(2):166-170.

        [4]鄭德義,王建明,賈一韜,等.p38絲裂原活化蛋白激酶在小鼠腸缺血再灌注肺損傷中的作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2010(3):254-257.

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        [7]王敏,俞詩源,劉佳昕,等.X射線輻射對小鼠腎組織中乳酸脫氫酶、Na+-K+ATP酶活性及caspase-3蛋白、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014(2):41-47.

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