鄭德義，王毅，杜嬌，李平洋，肖向陽(yáng)，程代薇，李自力

(貴州省人民醫(yī)院燒傷整形科，貴州貴陽(yáng)550002)

腸道缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion，II/R)損傷是嚴(yán)重創(chuàng)(燒)傷后常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，腸缺血再灌注不僅引起腸損傷，而且導(dǎo)致機(jī)體其他器官如肺、肝及腎臟等多器官損害［1］，發(fā)生多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至多器官衰竭死亡。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多以大鼠、兔等較大型嚙齒動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象［2-3］，且腸缺血及再灌注時(shí)間不一，本研究以小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探索建立穩(wěn)定的II/R誘發(fā)MODS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

10周齡健康雄性C57BL/6小鼠72只，體重22～26 g，根據(jù)觀察指標(biāo)隨機(jī)分組。分組1:腸缺血30 min組、40 min組、50 min組和60 min組，每組12只，手術(shù)后7 d時(shí)觀察腸缺血不同時(shí)間小鼠的生存率。分組2:假手術(shù)組(Sham，6只小鼠)，腸缺血40 min后再灌注組(II/R，18只小鼠)，分別于再灌注1 h、6 h和12 h(各6只)時(shí)取標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

參照文獻(xiàn)［4］實(shí)驗(yàn)，所有小鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注入1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，開(kāi)腹鈍性分離腸系膜前動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉腸系膜前動(dòng)脈(SMA)造成小鼠腸缺血，缺血相應(yīng)時(shí)間后松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注，關(guān)閉腹腔;假手術(shù)組不夾閉SMA(僅開(kāi)腹后關(guān)閉腹腔)。術(shù)后立即腹壁皮下注入生理鹽水1 mL，自由進(jìn)飲食。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

觀察分組1中的48只小鼠7 d內(nèi)的生存率，分組2中的24只小鼠分別于相應(yīng)時(shí)間，心臟穿刺抽血，室溫靜置、離心(4 000 g/min)15 min分離血清，-80℃保存，統(tǒng)一檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Crea)、乳酸脫氫酶(LDH)水平;腸缺血再灌注后6 h取右上肺葉、肝及腎臟組織做病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 II/R小鼠生存率

觀察腸缺血再灌注后7 d內(nèi)動(dòng)物生存狀況，隨著腸缺血時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠生存率明顯降低。在觀察期內(nèi)，腸缺血30 min小鼠全部存活，缺血40 min動(dòng)物生存率60%，缺血50 min小鼠生存率僅50%(在82 h半數(shù)動(dòng)物死亡)，腸缺血60 min小鼠生存率＜40%(在6 h時(shí)半數(shù)動(dòng)物死亡)。與腸缺血30 min比較，腸缺血50 min和60 min組小鼠死亡率明顯增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同腸缺血時(shí)間小鼠的生存率Fig.1 Mice survival rate in differentischemia time groups

2.2 血清ALT、AST、Crea和LDH

小鼠腸缺血再灌注1 h時(shí)，僅有Crea指標(biāo)高于假手術(shù)組(P＜0.01)，腸缺血后再灌注6 h，4項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);而在12 h血清指標(biāo)中僅有ALT及AST明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。結(jié)果提示，小鼠腸缺血再灌注損傷所引起的MODS在手術(shù)后6 h是最為顯著，是最佳時(shí)間點(diǎn)。見(jiàn)表1。

2.3 肺、肝和腎組織改變

假手術(shù)組小鼠肺、肝臟及腎臟組織形態(tài)正常。II/R后6 h肺、肝臟及腎臟發(fā)生病理改變，主要肺組織充血，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);肝細(xì)胞水樣變性、氣球樣變性，部分有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎小管上皮細(xì)胞水腫(圖2)。

表1 腸缺血后不同再灌注時(shí)間血清生化指標(biāo)變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

表1 腸缺血后不同再灌注時(shí)間血清生化指標(biāo)變化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

(1)與sham比較，P＜0.01

再灌注時(shí)間1 h 6 h 12 h ALT(u/L)40.25±2.63 56±20.07 179.5±141.59(1)128.33±89.67(1)生化指標(biāo)sham 1910.33±369.85 AST(u/L)195.75±57.53 156.67±22.37 483.33±176.31(1)365±117.29(1)Crea(mmol/L)5.25±0.96 17.67±12.58(1)10.33±1.86(1)8.00±2.65 LDH(u/L)1496.75±382.85 1406.33±1136.55 3119±947.58(1)

圖2 各組小鼠肺、肝和腎組織學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)Fig.2 The pathological change of lung，liver and kidney induced by II/R

3 討論

腸缺血再灌注是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷體克后救治過(guò)程中可能發(fā)生的一個(gè)共同的病理生理階段。腸缺血再灌注損傷后腸黏膜屏障受損及功能下降、促使腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位，氧自由基損害、中性粒細(xì)胞活化和各種炎性細(xì)胞因子的過(guò)度合成及釋放，誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肺、肝、腎臟等遠(yuǎn)隔臟器的損害［1］，是ARDS和MODS發(fā)生的重要原因［5-6］。研究II/R損傷的發(fā)病機(jī)制，首先建立穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)表明，隨著腸缺血時(shí)間增加，動(dòng)物存活率逐漸降低，腸缺血60 min組小鼠，再灌注6 h時(shí)半數(shù)動(dòng)物死亡，顯然不適合作為研究模型。腸缺血時(shí)間40～50 min小鼠在1周觀察期內(nèi)，半數(shù)以上存活，是較為理想的腸缺血時(shí)間。因此，選擇腸缺血40 min后再灌注1 h、6 h及12 h時(shí)，觀察肝、腎及全身組織器官功能損傷情況及血清AST、ALT、LDH及Crea水平。LDH幾乎存在于所有器官組織細(xì)胞內(nèi)，是有機(jī)體能量代謝過(guò)程中參與糖酵解的重要酶，當(dāng)組織器官發(fā)生病變時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，釋放更多的LDH到細(xì)胞間隙和體液，LDH水平是反應(yīng)細(xì)胞膜損傷較靈敏的指標(biāo)之一，是目前比較公認(rèn)測(cè)定細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸缺血再灌注1 h時(shí)血清學(xué)指標(biāo)僅有Crea高于假手術(shù)組，提示此時(shí)再灌注造成的損傷并不明顯;12 h時(shí)血清學(xué)指標(biāo)僅有ALT和AST高于假手術(shù)組，提示再灌注12 h時(shí)組織器官的修復(fù)功能可能部分恢復(fù);再灌注6 h時(shí)血清學(xué)4項(xiàng)指標(biāo)明顯高于假手術(shù)組，而且病理檢查提示，腸缺血后再灌注6 h，肺、肝臟及腎臟發(fā)生改變，主要表現(xiàn)組織細(xì)胞水腫、變性，伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示小鼠缺血再灌注6 h是觀察MODS模型的最佳時(shí)間點(diǎn)。模型制作過(guò)程中，因小鼠體形小，要求手術(shù)操作熟練、輕柔、精細(xì)，減少腹腔臟器的翻動(dòng)，術(shù)中、術(shù)后注意保溫，缺血期間斷縫合或蚊式鉗夾閉暫時(shí)關(guān)閉腹腔，以防腸組織及腹腔體液外滲。

綜上所述，應(yīng)用阻斷小鼠腸系膜上動(dòng)脈40～50 mim再灌注6 h，既能保證動(dòng)物生存率，滿足實(shí)驗(yàn)要求，又能形成腸道及遠(yuǎn)隔器官損傷及功能障礙，為進(jìn)一步研究腸缺血再灌注誘發(fā)MODS發(fā)病機(jī)制的提供依據(jù)。

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