李 寧 張春芝 崔 文 王文軍Δ 李炳輝

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與法醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在美國前列腺發(fā)病率位居男性惡性腫瘤第一位［1－4］。我國前列腺癌發(fā)病率近年來一直呈現(xiàn)上升趨勢，成為影響男性健康的惡性腫瘤之一［1］。隨著我國老齡化人口的加快，生活方式的改變，前列腺癌發(fā)病率將進(jìn)一步上升，因此，迫切需要研究預(yù)防、治療前列腺癌的方法［2，5］。

近年來，人們越來越多的關(guān)注食品和食品組分在疾病預(yù)防中的作用。從大蒜中提取的大蒜素（含硫有機(jī)化合物）是一種具有顯著生物活性的植物化學(xué)物。流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明大蒜素具有抑制腫瘤、抗感染、降低膽固醇等作用［6－8］。本實(shí)驗(yàn)通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)，研究大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

前列腺癌DU145細(xì)胞由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、0．25%胰蛋白酶購自GIBCO公司；大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自凱基生物公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國康寧公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存管中的DU145細(xì)胞于37℃溫水中迅速解凍，離心收集細(xì)胞，采用含有10%小牛血清、50U／ml青霉素、50μg／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1．2．2 MTT比色法檢測大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響 用0．25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液稀釋至1．0×105個(gè)／ml。96孔板每孔加入稀釋好的細(xì)胞懸液100μL，培養(yǎng)24h。24h后加入以DMEM全培養(yǎng)基稀釋的大蒜素溶液，濃度分別為10．0、20．0、40．0、80．0、160．0μg／ml，同時(shí)設(shè)置只添加 DMEM 全培養(yǎng)基的空白對照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別培養(yǎng)24h、48h、72h；按照凱基生物 MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書中的方法，測定不同藥物濃度處理細(xì)胞在490nm處的吸光度值。細(xì)胞存活率＝（大蒜素孔OD／對照孔OD）×100%［9］。

1．2．3 細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期的前列腺癌DU145細(xì)胞，接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48h，分別加入大蒜素0、40μg／ml，培養(yǎng)24h，按照碧云天細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞固定及染色，用流式細(xì)胞儀檢測光散射情況及488nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13．0進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的抑制作用

實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明，10．0、20．0、40．0、80．0、160．0μg／ml濃度的大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖均具有抑制作用。DU145細(xì)胞生存率隨大蒜素劑量的增加而減小，同一濃度的大蒜素作用下隨著時(shí)間延長存活率減小，表現(xiàn)出濃度、時(shí)間依賴性，細(xì)胞生存率與空白對照組有顯著差異（P＜0．05）。見表1。

2．2 大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞周期影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，前列腺癌DU145細(xì)胞經(jīng)過大蒜素處理24h后，與對照組比較，G0／G1細(xì)胞所占比例顯著下降，80μg／ml組下降大于40μg／ml組；G2／M 期細(xì)胞所占比例顯著上升，80μg／ml組上升大于40μg／ml組。見表2。

表2 大蒜素對DU145細(xì)胞周期的影響（%，ˉx±s）

表1 不同濃度、不同作用時(shí)間大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞存活率（%）

3 討論

大蒜作為人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参?，所含有的大蒜素是一種對人體有益的生物活性物質(zhì)。Kim等［10］基于美國FDA以證據(jù)為基礎(chǔ)的審查系統(tǒng)的研究證明大蒜素對胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌具有潛在的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素通過對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞周期的阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式作起到抗腫瘤效果。在人類結(jié)腸癌及未分化甲狀腺癌細(xì)胞研究中，大蒜素通過影響線粒體信號(hào)通路將細(xì)胞阻滯在G2／M，并且出現(xiàn)凋亡峰［11］。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，作為一類細(xì)胞周期性疾病，通過影響細(xì)胞周期抑制腫瘤細(xì)胞無限增殖是預(yù)防和治療腫瘤的一種方法。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度大蒜素對前列腺癌DU145細(xì)胞作用不同時(shí)間，證明大蒜素對DU145細(xì)胞增殖具有抑制作用，隨著大蒜素使用劑量、作用時(shí)間的增加，抑制作用增強(qiáng)。本文流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，大蒜素對DU145細(xì)胞的細(xì)胞周期具有顯著性的影響，隨著大蒜素使用劑量的增加，G0／G1期所占比例下降，G2／M期所占比例提高，大蒜素將DU145細(xì)胞阻滯在G2／M期。

通過大蒜素抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的研究結(jié)果，以及眾多流行病學(xué)研究結(jié)果，大蒜素具有抑制腫瘤的作用，可用于前列腺癌患者的輔助治療。日常飲食中，經(jīng)常食用大蒜具有降低癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

［1］ 韓蘇軍，張思維，陳萬青，等．中國前列腺癌死亡現(xiàn)狀及流行趨勢分析［J］．中華泌尿外科雜志，2012，33（11）：836－839．

［2］ 韓蘇軍，張思維，陳萬青，等．中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析［J］．臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18（4）：330－334．

［3］ 唐志柳，白潔，顧麗娜，等．2000～2010年我國前列腺癌和乳腺癌流行狀況的系統(tǒng)性疾?。跩］．中國腫瘤，2013，22（4）：260－265．

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