邢言言, 佟 玲, 陳 楠, 于治國, 趙云麗*

(1. 沈陽藥科大學藥學院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 天士力控股集團研究院藥物分析所, 天津 300402)

技術(shù)與應(yīng)用

免疫磁珠富集凈化-超高效液相色譜法同時測定陳皮中4種黃曲霉毒素

邢言言1, 佟 玲2, 陳 楠2, 于治國1, 趙云麗1*

(1. 沈陽藥科大學藥學院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 天士力控股集團研究院藥物分析所, 天津 300402)

將ProtElut NHS(N-羥基丁二酰亞胺)偶聯(lián)磁珠與抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體偶聯(lián)得到黃曲霉毒素總量免疫磁珠,其具有較好的分散性,良好的磁性能和特異的選擇性。本文建立了陳皮中4種黃曲霉毒素的免疫磁珠富集凈化,超高效液相色譜(UPLC)檢測方法。樣品經(jīng)甲醇-PBS緩沖溶液(2∶8, v/v)提取后用免疫磁珠富集凈化,1 mL甲醇洗脫;經(jīng)ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)分離,以水和甲醇為流動相梯度洗脫,采用汞/氙燈熒光檢測器測定。實驗結(jié)果表明,4種黃曲霉毒素在各自的線性范圍內(nèi)峰面積與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.999;檢出限(信噪比為3)為0.013～0.038 μg/kg,定量限(信噪比為10)為0.044～1.2 μg/kg;平均回收率為63.9%～115.0%,相對標準偏差為0.4%～14.2%,均符合痕量分析的要求。該方法簡單快速、準確可靠,可用于陳皮中4種黃曲霉毒素的測定。

免疫磁珠;超高效液相色譜法;黃曲霉毒素;陳皮

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是由黃曲霉和寄生曲霉在繁殖過程中產(chǎn)生的一類分子結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物,被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)(IARC)劃定為I類致癌物[1]。目前報道的AFs有20多種[2],中藥材在采收、貯存、加工和炮制過程中處理不當易被AFs污染,較常見的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2),其中AFB1的毒性最強?！吨袊幍洹?010年版一部規(guī)定陳皮、桃仁、酸棗仁、僵蠶和胖大海5味藥材需進行AFs檢測,其中AFB1限量為5 μg/kg, AFB1+AFB2+AFG1+AFG2限量為10 μg/kg[3]。

對于痕量分析而言,樣品的前處理對整個分析過程顯得至關(guān)重要。目前,AFs的前處理方法主要包括有機溶劑萃取法和免疫親和色譜法等。有機溶劑萃取法存在過程復雜、毒性大、耗時等缺點,且最終提取物中易存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物,會對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾[4,5]。與有機溶劑萃取法相比,免疫親和色譜法提高了試樣的凈化效率,且減少了有毒有害試劑的使用,但樣品前處理較復雜,對操作人員的技術(shù)要求較高。免疫磁珠分離技術(shù)是20世紀70年代后期發(fā)展起來的一項與磁載體結(jié)合的免疫學技術(shù),它同時具備了免疫學反應(yīng)的高度專一性以及固相化試劑所特有的優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于分離及濃縮特定細胞、微生物、蛋白質(zhì)和核酸片段等肉眼難以觀察或樣品中含量不高的物質(zhì)[6,7]。免疫磁珠分離技術(shù)的原理是內(nèi)含F(xiàn)e3O4的納米磁珠的表面修飾官能團與抗體結(jié)合構(gòu)成免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMBs),免疫磁珠富集凈化體系的作用力是外界磁場,磁性納米顆粒在磁場中可定向運動,從而在反應(yīng)結(jié)束后能利用磁鐵實現(xiàn)反應(yīng)體系和未反應(yīng)體系的快速分離,避免了繁瑣的過濾或離心過程,且消耗溶劑少,操作簡單,大大縮短了前處理時間。

關(guān)于AFs的檢測方法有酶聯(lián)免疫法[8]、薄層色譜法[9]、熒光分光光度計法[10,11]、HPLC法[12-14]、UPLC法[15]及LC-MS聯(lián)用法[16,17]等。酶聯(lián)免疫法適用于AFs的快速篩查,但重復性差,假陽性出現(xiàn)率較高;薄層色譜法由于靈敏度低及重復性差,目前應(yīng)用較少;HPLC法是目前應(yīng)用最多的定量檢測方法,但由于AFB1和AFG1與水接觸后會產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象,原有較強的熒光特性基本消失,分析時一般需要柱前或柱后衍生,檢測步驟增加,造成分析速度較慢,耗費有機溶劑較多,費時費力。LC-MS聯(lián)用法能夠同時進行定性和定量分析,能有效排除假陽性結(jié)果,但儀器昂貴,不易推廣。UPLC法借助于HPLC法的理論及原理,涵蓋了小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù),與傳統(tǒng)的HPLC法相比,增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量,縮短了分析時間,同時減少了溶劑用量,降低了分析成本。此外,本文選用的熒光檢測器使用了汞/氙燈,而汞在365 nm下發(fā)射強度比氙燈高10倍。這種超強的發(fā)射強度實現(xiàn)了AFB1和AFG1在不衍生的情況下依然保持較強的信號。加上小容量熒光檢測池的高靈敏度,省去了衍生的步驟,大大縮短了檢出周期,提高了檢測速度和重復性。

本研究將免疫磁珠用于陳皮中AFs的富集凈化,同時結(jié)合UPLC法進行定量分析。通過優(yōu)化前處理和色譜分析條件,建立了對陳皮中AFs具有高選擇性的高靈敏度分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀(美國Waters公司); ACQUITY UPLC FLR熒光檢測器(美國Waters公司); KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);日立CF16RN高速冷凍離心機(天美科學儀器有限公司); Vortex-Genie2多功能渦旋混合器(美國Scientific Industries公司); S-4800型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); Nicolet Nexus 470型傅里葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司); K5500超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液(質(zhì)量濃度:B1, 1.0 μg/mL; B2, 0.3 μg/mL; G1, 1.0 μg/mL; G2, 0.3 μg/mL;美國Supelco公司);抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體(anti-total aflatoxins monoclonal antibody, AFT;華安麥科生物技術(shù)有限公司); ProtElut NHS(N-羥基丁二酰亞胺)偶聯(lián)磁珠(英芮誠生化科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA) (生化試劑,國藥試劑有限公司);考馬斯亮藍G-250染料試劑(生化試劑,上海遠慕生物科技有限公司);甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。實驗用水為美國Millipore公司Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水。

陳皮藥材購于河北省安國中藥材市場,產(chǎn)地為四川省。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

PBS稀釋液:稱取氯化鈉4.0 g,磷酸氫二鈉0.71 g,磷酸二氫鉀0.135 g,氯化鉀0.10 g,用490 mL水溶解,飽和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4,加水稀釋至500 mL,混勻,即得。

對照品溶液:精密量取黃曲霉毒素混合標準溶液0.5 mL,置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的質(zhì)量濃度分別為50、15、50、15 ng/mL)。精密量取儲備液1 mL,置于25 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

1.2.2 免疫磁珠的制備

將1 mg AFT與60 mg ProtElut NHS磁珠混合,加入含0.02%(質(zhì)量分數(shù))疊氮鈉的PBS溶液1 mL。4 ℃下孵育8 h后磁性分離,棄去上清液;加乙醇胺封閉緩沖液,室溫孵育1 h后用PBS清洗3次,加入含0.02%(質(zhì)量分數(shù))疊氮鈉的PBS溶液混懸,于4 ℃下保存,待用。利用Bradford蛋白定量法測定AFT和NHS磁珠的偶聯(lián)效率。

1.2.3 供試品溶液的制備

將陳皮樣品粉碎,過3號篩。精密稱取1.0 g,加氯化鈉0.2 g,置于50 mL離心管中,精密加入20%(體積分數(shù))甲醇-PBS緩沖溶液(pH 7.4)10 mL,超聲10 min,離心3 min(轉(zhuǎn)速10 000 r/min);精密量取3 mL上清液加入到洗滌好的免疫磁珠(3 mg)中,渦旋富集10 min。用磁鐵將免疫磁珠快速吸附到離心管一側(cè),吸取上清液,再加入20%(體積分數(shù))甲醇-PBS緩沖溶液(pH 7.4)洗滌1次。移除洗滌液后,用1 000 μL純甲醇洗脫吸附AFs后的免疫磁珠3次(前兩次每次用400 μL,最后1次用200 μL),收集洗脫液,過0.22 μm濾膜。

1.2.4 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動相:A為水,B為甲醇;梯度洗脫程序:0～9.0 min, 70%A～38%A; 9.0～10.0 min, 38%A～0%A; 10.0～10.1 min, 0%A～70%A; 10.1～12.0 min, 70%A。流速:0.3 mL/min。柱溫:30 ℃。進樣量:5 μL。熒光檢測器激發(fā)波長:365 nm;發(fā)射波長:450 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫磁珠的表征與分析

2.1.1 免疫磁珠的表征

用掃描電子顯微鏡和傅里葉紅外光譜儀觀察偶聯(lián)AFT前后的NHS納米磁珠的晶體形態(tài)、大小及紅外吸收情況(見圖1和圖2)。從圖1a和圖1b中可以看到修飾有NHS基團的Fe3O4粒徑分布均勻,約120 nm,分散性良好,無聚團現(xiàn)象。單個NHS納米磁珠的表面仍由很多細小顆粒構(gòu)成,說明NHS基團對Fe3O4的修飾過程并未影響Fe3O4核,而且較大的表面積利于AFT的偶聯(lián)。圖1c和圖1d表明偶聯(lián)了AFT的NHS磁珠分散性依然很好,無聚團現(xiàn)象,具有較好的形貌。從圖2a中可以看到572 cm-1處為Fe3O4的紅外吸收峰,圖2b中569 cm-1處也有Fe3O4的紅外吸收峰,說明AFT的修飾對Fe3O4自身無影響。此外,圖2b中也有偶聯(lián)AFT后的一些基團的紅外吸收峰,3 416 cm-1處為AFT的O-H的吸收峰;1 542 cm-1為N-H鍵的變形振動峰,是偶聯(lián)后的AFT的N-H鍵所致;1 636 cm-1是AFT分子內(nèi)C=O雙鍵的吸收峰;1 076 cm-1是AFT分子內(nèi)C-O單鍵的吸收峰。說明AFT成功修飾在NHS磁珠表面。

2.1.2 NHS磁珠與AFT的偶聯(lián)

NHS磁珠外表面的NHS基團與AFT的伯氨基團反應(yīng),形成C-N共價鍵,實現(xiàn)AFT與磁珠的共價偶聯(lián)。利用此原理,本實驗成功將AFT偶聯(lián)到NHS磁珠表面。采用Bradford蛋白定量法測定抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體和NHS磁珠的偶聯(lián)效率(以BSA為標準物繪制Bradford標準曲線),平均偶聯(lián)率為99%,由此說明1 mg AFT基本全部被60 mg ProtElut NHS磁珠偶聯(lián)。

2.2 免疫磁珠富集凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 免疫磁珠富集凈化的溫度與pH值

免疫磁珠富集凈化使用的抗原、抗體多在15～40 ℃范圍內(nèi)反應(yīng),過高的溫度會使抗原、抗體失活。參考商品化的黃曲霉毒素總量免疫親和柱使用前需恢復至室溫(22～25 ℃),本文也選擇將制備好的免疫磁珠恢復至室溫進行實驗。

抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)必須在合適的pH值環(huán)境中進行,一般pH值為6～8。pH值過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì),pH值達到或接近抗原的等電點時,即使無相應(yīng)的抗體存在,也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集,造成假陽性反應(yīng)。常用的抗原、抗體反應(yīng)pH值為7.4[18],而保存AFT的PBS緩沖溶液pH值也為7.4,因此免疫磁珠凈化體系的pH值定為7.4。

圖 1 偶聯(lián)AFT(a, b)前和(c, d)后的NHS磁珠掃描電鏡圖Fig. 1 Photographs of scanning electron microscope (SEM) of ProtElut NHS magnetic beads (a, b) before and (c, d) after coupling AFT

圖 2 偶聯(lián)AFT(a)前和(b)后的ProtElut NHS磁珠紅外光譜圖Fig. 2 Photographs of Fourier transform infrared spectroscopy of ProtElut NHS magnetic beads (a) before and (b) after coupling AFT

2.2.2 免疫磁珠的使用量

免疫磁珠富集凈化樣品時,吸附是關(guān)鍵步驟,為更好地控制免疫磁珠對AFs的吸附量,本文對免疫磁珠的使用量進行了優(yōu)化。分別稱取0.5、1、3、5、7 mg免疫磁珠,加入含黃曲霉毒素(AFB1: 3 ng/mL; AFB2: 0.9 ng/mL; AFG1: 3 ng/mL; AFG2: 0.9 ng/mL)的甲醇-PBS緩沖溶液(2∶8, v/v)溶液3 mL,使免疫磁珠與樣品溶液充分混合,不同質(zhì)量的免疫磁珠對4種AFs回收率的影響如圖3a所示。在0.5～3 mg范圍內(nèi),隨磁珠量的增大,AFs的回收率顯著增大;當磁珠量增至3 mg后,4種AFs的回收率不再增加,基本趨于飽和。因此最終選擇免疫磁珠的加入量為3 mg。

2.2.3 免疫磁珠富集凈化的時間

在pH 7.4及室溫條件下,考察了不同富集吸附時間下免疫磁珠對4種AFs的富集凈化效果。結(jié)果(見圖3b)表明,10 min后免疫磁珠對4種AFs的富集量基本達到飽和。故最終確定富集凈化時間為10 min。

2.2.4 免疫磁珠的洗脫體積與洗脫時間

為了確定洗脫液甲醇對免疫磁珠的洗脫體積與洗脫時間,分別使用400、800、1 000、1 200 μL甲醇對免疫磁珠進行洗脫,實驗結(jié)果(見圖3c)表明，當洗脫體積為1 000 μL時,4種AFs的回收率均較高,洗脫效果較好。洗脫時將甲醇加入反應(yīng)體系內(nèi),分別振搖1、2、3、4、5 min,結(jié)果(見圖3d)表明,振搖至3 min時洗脫已基本完成。故最終確定甲醇的洗脫體積為1 000 μL,洗脫時間為3 min。

圖 3 (a)免疫磁珠的加入量、(b)富集時間、(c)洗脫液的體積和(d)洗脫時間對AFs回收率的影響Fig. 3 Effects of (a) the amount of immune magnetic beads, (b) enrichment time, (c) elution volume and (d) elution time on the recoveries of AFs Extraction conditions: sample, 3.0 mL AFs mixed standard solution (AFB1: 3 ng/mL; AFB2: 0.9 ng/mL; AFG1: 3 ng/mL; AFG2: 0.9 ng/mL); 20%(v/v) methanol-PBS buffer solution (pH7.4); room temperature.

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本文采用不同比例的甲醇-水系統(tǒng)等度和梯度洗脫分離陳皮樣品中的4種AFs,并考察了ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)及ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對陳皮樣品中4種AFs的分離情況。結(jié)果表明,在1.2.4節(jié)所述的色譜條件下,基本無雜質(zhì)峰出現(xiàn)且樣品和標準樣品的峰形較好,分離效果最佳,色譜圖見圖4。由于黃曲霉毒素B1和G1接觸水后易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象,因此常規(guī)分析時需柱前或者柱后衍生,費時費力。本文使用FLR熒光檢測器,其汞/氙燈的汞在365 nm下發(fā)射強度比氙燈高10倍,因此黃曲霉毒素B1和G1不經(jīng)過衍生響應(yīng)信號依然較強。在本文選擇的激發(fā)光波長為365 nm、發(fā)射波長為450 nm時熒光檢測器的檢測靈敏度最高。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性

從圖4可以看出方法的專屬性良好,陳皮中的其他物質(zhì)不干擾4種AFs的測定。

2.4.2 線性范圍和相關(guān)系數(shù)

取黃曲霉毒素混合對照品儲備液,用甲醇稀釋成系列濃度的混合對照溶液,分別進樣5 μL,記錄色譜圖,以質(zhì)量濃度x(ng/mL)為橫坐標,峰面積y為縱坐標,繪制標準曲線,得到線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(見表1)。

2.4.3 檢出限和定量限

在陰性樣品中加入不同量的黃曲霉毒素混合對照品儲備溶液,按建立的方法進行樣品前處理和測定。以信噪比為3(S/N=3)確定檢出限,4種AFs的檢出限為0.013～0.038 μg/kg;以S/N=10確定定量限,4種AFs的定量限為0.044～1.2 μg/kg。

表 1 4種黃曲霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the four aflatoxins

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

圖 4 AFs的超高效液相色譜圖Fig. 4 UPLC chromatograms of AFs a. mixed standard solution (AFB1: 2 ng/mL; AFB2: 0.6 ng/mL; AFG1: 2 ng/mL; AFG2: 0.6 ng/mL); b. Citrus reticulatablanco spiked with AFs (as 2 μg/kg of AFB1); c. blank Citrus reticulatablanco sample.

2.4.4 儀器精密度

取黃曲霉毒素混合對照溶液(AFB1: 2 ng/mL; AFB2: 0.6 ng/mL; AFG1: 2 ng/mL; AFG2: 0.6 ng/mL),連續(xù)進樣6次,記錄峰面積,計算4種AFs的RSD。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的RSD分別為0.6%、0.6%、1.6%、1.0%,表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性

精密稱取1.0 g陰性樣品,以AFB1計為5 μg/kg的水平添加黃曲霉毒素混合對照品儲備溶液,按建立的方法制備供試品溶液,于制備后0、2、4、6、8、12 h進樣分析,記錄峰面積,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD分別為1.0%、0.8%、0.9%、0.9%。表明陳皮加標提取液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加標回收率和重復性

以陳皮的空白樣品進行3個水平的添加回收試驗,每個加標水平重復6次,計算回收率和相對標準偏差。結(jié)果(見表2)表明,平均回收率介于63.9%和115.0%之間,RSD為0.4%～14.2%?；厥章屎椭貜托詳?shù)據(jù)均滿足國際食品法典委員會對痕量物質(zhì)分析的方法學要求[19]。

表 2 4種黃曲霉毒素的加標回收率及其相對標準偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and the RSDs of the four aflatoxins (n=6)

2.5 樣品測定

采用本文建立的方法分別測定6批陳皮樣品,均未檢出黃曲霉毒素。為了排除假陰性結(jié)果,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對該6批陳皮樣品進行結(jié)果復核實驗。結(jié)果表明6批陳皮樣品均不含4種AFs。同時也證明了本文建立的方法準確可靠。

3 結(jié)論

本文制備的一種黃曲霉毒素總量(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)免疫磁珠分散性好。將其用于富集凈化黃曲霉毒素,操作簡單,凈化富集效果好。建立的新型免疫磁珠富集凈化-超高效液相色譜檢測中藥材陳皮中黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的方法,無需衍生化,靈敏度高,結(jié)果準確可靠。

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Simultaneous determination of four aflatoxins inCitrusreticulatablancoby ultra performance liquid chromatography coupled with immunomagnetic beads for enrichment and purification

XING Yanyan1, TONG Ling2, CHEN Nan2, YU Zhiguo1, ZHAO Yunli1*

(1.SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.PharmaceuticalAnalysisInstituteofTaslyHoldingGroup,Tianjin300402,China)

Immunomagnetic beads (IMBs) were formed by coupling the ProtElut NHS (N-hydroxysuccinimide) magnetic beads and anti-aflatoxins monoclonal antibody. The synthesized IMBs presented uniform size, good magnetic property and specific selectivity. In this work, a novel and facile pretreatment method of sample enrichment and purification based on the IMBs for the determination of aflatoxins (AFs) (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) inCitrusreticulatablancosamples by ultra performance liquid chromatography (UPLC) were developed. The sample was extracted with 20%(v/v) methanol-PBS buffer solution (pH 7.4), followed by a cleanup procedure with the IMBs. The target compounds were eluted using 1 mL methanol. The four afatoxins were separated on an ACQUITY UPLC HSS T3 C18column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) adopting a gradient program within 12 min. The UPLC equipped with a fluorescence detector with a special mercury/xenon lamp was used to detect the aflatoxins. The satisfactory correlation coefficients (r2>0.999) of the four aflatoxins were obtained within their respective linear ranges. The limits of detection (S/N=3) were between 0.013 μg/kg and 0.038 μg/kg, and the limits of quantification (S/N=10) were between 0.044 μg/kg and 1.2 μg/kg. The recoveries were in the range of 63.9%-115.0% with the relative standard deviations (RSDs) of 0.4%-14.2%. The validation results meet the requirements of trace assay. It’s indicated that the IMBs were good pretreatment alternatives and the developed method is simple, fast, accurate, and can be applied for the simultaneous determination of the four aflatoxins inCitrusreticulatablanco.

immunomagnetic beads (IMBs); ultra performance liquid chromatography (UPLC); aflatoxins (AFs);Citrusreticulatablanco

10.3724/SP.J.1123.2015.06001

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09402202).

2015-06-01

O658

A

1000-8713(2015)12-1320-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(024)23986295,E-mail:yunli76@163.com.