劉 潔, 佟 玲, 孟文婷, 趙云麗, 于治國*

(1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 天士力控股集團(tuán)研究院藥物分析所, 天津 300402)

研究論文

固相萃取-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定當(dāng)歸中135種農(nóng)藥及其代謝物殘留

劉 潔1, 佟 玲2, 孟文婷2, 趙云麗1, 于治國1*

(1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 天士力控股集團(tuán)研究院藥物分析所, 天津 300402)

建立了超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)同時測定當(dāng)歸藥材中135種農(nóng)藥及其代謝物(包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等)殘留量的分析方法。以回收率為考察指標(biāo),評估了不同的提取溶劑、固相萃取小柱、洗脫溶劑及體積對當(dāng)歸中多農(nóng)殘的提取凈化效果,最終確定樣品經(jīng)乙腈提取,PSA固相萃取柱凈化處理,在電噴霧正離子掃描、依賴保留時間的多反應(yīng)監(jiān)測模式(scheduled MRM)下,以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明,135種農(nóng)藥及其代謝物在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99); 3個添加水平(10、50、100 μg/kg)下,除了烯草酮回收率偏低(62.0%～68.2%)外,其余農(nóng)藥的回收率為71.3%～119.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)不大于19.9%, 135種農(nóng)藥及其代謝物的定量限為1.0～10.0 μg/kg。該方法樣品前處理簡單、快速、靈敏,可用于當(dāng)歸藥材中多類別農(nóng)藥殘留量的定性、定量。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;固相萃取;多類別農(nóng)藥及其代謝物;當(dāng)歸

當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)為傘形科(Umbelliferae)當(dāng)歸屬多年生草本藥用植物?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明,當(dāng)歸對多種疾病特別是心血管系統(tǒng)疾病有很好的療效,同時具有抗腫瘤、改善肺功能、提高免疫力等藥理活性。近年來由于當(dāng)歸種植面積擴(kuò)大,病害逐年加重[1]。藥農(nóng)為保證產(chǎn)量在種植過程中使用大量農(nóng)藥以防病蟲害,如使用呋喃丹、吡蟲啉、毒死蜱、多菌靈等農(nóng)藥防治麻口病等病害[2,3],利用除草劑撲草凈解決除草難問題等[4]。當(dāng)歸病蟲害防治中允許使用的有機(jī)合成農(nóng)藥包括殺蟲劑、殺螨劑、殺菌劑、除草劑,而此類農(nóng)藥只允許在中藥材生產(chǎn)上限量使用。因此過量使用農(nóng)藥易引發(fā)殘留超標(biāo)問題。農(nóng)藥殘留量的超標(biāo)不僅危害人類的健康、損害消費(fèi)者的利益,也是制約中藥走向國際市場的瓶頸。歐盟、美國、日本及國際食品法典委員會(CAC)等國家和組織[5-7]對部分中草藥中的有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥均制定了最高殘留限量(MRL)。因此,建立當(dāng)歸藥材中多類別農(nóng)藥殘留的檢測方法,對保證用藥安全及推進(jìn)中藥現(xiàn)代化、國際化具有重要的意義。

農(nóng)藥多殘留分析需解決的主要問題之一是去除共提取基質(zhì)干擾物對定量準(zhǔn)確度、靈敏度及儀器污染的影響。因此,樣品前處理中對基質(zhì)凈化方法的選擇及優(yōu)化是多殘留檢測的關(guān)鍵。固相萃取技術(shù)具有吸附容量大、凈化效果好、易與檢測儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于中藥材農(nóng)藥多殘留分析[8-10],是當(dāng)前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普遍采用的前處理方法。

傳統(tǒng)的儀器檢測方法,如氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC),難以消除復(fù)雜基質(zhì)的干擾。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)雖在中藥材農(nóng)藥殘留檢測方面做出很大的貢獻(xiàn),如程志等[11]采用GC-MS快速篩查了11味中藥材中的144種農(nóng)藥。但GC-MS常常會受到化合物極性及處理過程相對復(fù)雜、耗時等限制[10],且其定量限一般較高,難以滿足國際社會對農(nóng)藥殘留限量日益嚴(yán)格的檢測要求[12]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MSn)憑借快速、抗干擾能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢,已成為痕量定量分析的首選方法[13]。

本文對固相萃取前處理方法中提取和凈化步驟進(jìn)行了優(yōu)化和評估,結(jié)合靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的LC-MS/MS技術(shù),以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法一次進(jìn)樣即可完成當(dāng)歸藥材中多類別農(nóng)藥殘留的定性、定量分析,并應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測。該方法具有操作簡單、靈敏度高、應(yīng)用廣的特點(diǎn),對當(dāng)歸藥材的安全監(jiān)測有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源、三重四極桿-線性離子阱質(zhì)量分析器及Analyst 1.6.2工作站(美國AB SCIEX公司)、MultiQuant 3.0.2數(shù)據(jù)處理軟件;LC-30AD UFLC液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)。

乙腈為色譜純(德國Merck公司);無水硫酸鎂為優(yōu)級純(Sigma-Aldrich);醋酸鈉為分析純(天津市化學(xué)試劑一廠); PSA固相萃取柱(500 mg/6 mL)、CARB固相萃取柱(500 mg/6 mL)、CARB/NH2固相萃取柱(250 mg/250 mg/6 mL)、C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Florisil固相萃取柱(500 mg/6 mL)和NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)均為DIKMA科技公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)所制超純水。

135種農(nóng)藥及其代謝物、內(nèi)標(biāo)d5-莠去津標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%),購自德國Dr. Ehrenstorfer公司與中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

中藥材樣品(10批當(dāng)歸),產(chǎn)地為甘肅，由天津天士力中藥資源有限公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

單標(biāo)準(zhǔn)儲備液:取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.001 mg),分置于10 mL量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,儲存于4 ℃冰箱中,備用。

混合儲備液:分別準(zhǔn)確吸取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用0.05%(v/v)乙酸乙腈溶液定量稀釋,制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L的混合儲備液,于-20 ℃冰箱中保存。

內(nèi)標(biāo)溶液:取d5-莠去津標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.001 mg),置于10 mL量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的內(nèi)標(biāo)儲備液;準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)儲備液適量,用乙腈定量稀釋,制成質(zhì)量濃度為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液,儲存于4 ℃冰箱中,備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取系列體積的混合儲備液,分置于5 mL量瓶中,各加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL,用乙腈稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、80 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:按照1.3節(jié)步驟提取不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品,將獲得的提取液作為稀釋溶劑,按照上述“標(biāo)準(zhǔn)工作溶液”的配制,制成相同濃度梯度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取當(dāng)歸藥材粉末2 g(精確至0.01 g),置于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、水10 mL,浸潤30 min后,準(zhǔn)確加入乙腈10 mL,于渦旋混合振蕩儀振蕩(5 000 r/min)2 min,向離心管中加入無水硫酸鎂4 g和醋酸鈉1 g,手動振搖5 min,離心(5 000 r/min)5 min。

取上清液1 mL,加至預(yù)先用乙腈-甲苯(20∶1, v/v)5 mL活化的固相萃取小柱中,用乙腈-甲苯(20∶1, v/v)20 mL分4次淋洗小柱,合并洗脫液,在38 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用乙腈1 mL溶解殘?jiān)?經(jīng)0. 22 μm濾膜過濾,濾液作為供試溶液。

1.4 UFLC-MS/MS條件

1.4.1 UFLC條件

色譜柱:Acquity HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm，Waters公司);流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 95%A; 1.0～4.0 min, 95%A～40%A; 4.0～14.0 min, 40%A～0%A; 14.0～15.0 min, 0%A; 15.0～18.0 min, 95%A。

1.4.2 MS/MS條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:依賴保留時間的多反應(yīng)監(jiān)測(scheduled MRM)模式;離子化電壓(IS): 5 500 V;霧化溫度(TEM): 550 ℃;氣簾氣壓力(CUR): 241.3 kPa (35 psi);噴霧氣壓力(Gas 1): 379.3 kPa (55 psi);輔助加熱氣壓力(Gas 2): 379.3 kPa (55 psi);碰撞氣壓力(CAD):中等(medium)。

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥種類的選擇

本研究根據(jù)農(nóng)藥的理化性質(zhì),依據(jù)GB/T 20769-2008,并參考美國、歐盟等國家和組織[14,15]對植物藥中有關(guān)農(nóng)藥殘留檢測項(xiàng)目,篩選了中藥材生產(chǎn)中常用的135種不適合直接采用氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定的農(nóng)藥及其代謝物。

2.2 UFLC-MS/MS條件的優(yōu)化

采用MS-only模式,直接進(jìn)樣方式,對單一化合物逐個進(jìn)行優(yōu)化。首先進(jìn)行Q1全掃描,識別目標(biāo)物的母離子,參考?xì)W盟指令(2002/657/EC)[16],對該母離子進(jìn)行Q2掃描。每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量與定性離子對。各農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。應(yīng)用scheduled MRM掃描方式,可確保每個色譜峰有足夠的采集數(shù)據(jù)點(diǎn)(每個色譜峰點(diǎn)數(shù)在12～20之間)。

為了保證各農(nóng)藥化合物具有良好峰形以及足夠的靈敏度,本文考察了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)以及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10 mmol/L甲酸銨)4種流動相體系。甲酸的加入,可促進(jìn)化合物的離子化[12]。因此,當(dāng)流動相中加入0.1%(v/v)甲酸時,各化合物的響應(yīng)明顯增強(qiáng)。鹽的加入,不僅可影響化合物的保留能力、峰形,也可增強(qiáng)或抑制化合物的離子化作用。分別嘗試加入5 mmol/L和10 mmol/L甲酸銨,發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增加,化合物的響應(yīng)逐漸減弱,說明鹽對化合物的電離產(chǎn)生抑制作用。依據(jù)電噴霧電離的機(jī)理,選擇有利于化合物去質(zhì)子化的乙腈為有機(jī)相[10]。因此本文以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相。

表 1 135種農(nóng)藥及其代謝物的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the 135 pesticides and their metabolites

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* for quantitative ion; ** qualitative ion response/quantitative ion response×100%; *** internal standard.

圖 1 使用不同提取溶劑時當(dāng)歸提取液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of Angelica sinensis extract with different extraction solvents

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 水用量的確定

由于中藥材含水量較少,直接使用有機(jī)溶劑難以有效提取待分析物。因此需加入一定量的水,以確保樣品中的待分析物較容易地被提取出來。稱取藥材2 g,分別加入水5、10和15 mL,靜置30 min。結(jié)果顯示,5 mL水不能使藥材完全浸潤,而15 mL水量過多,影響液-液分配效率,降低回收率。因此,最終確定中藥材取樣量為2 g,添加水量為10 mL。

2.3.2 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留檢測前處理中常用的提取劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等,本文分別從凈化效果、提取回收率兩方面考察了這3種溶劑對135種農(nóng)藥及其代謝物的提取情況。從凈化效果(見圖1)看,乙酸乙酯由于對水的溶解度較低,極性干擾物不易被同時提取;丙酮極性較大，且與水互溶,易將水溶性的極性干擾物(如色素)一并提取出來,使后續(xù)的凈化步驟難度加大,導(dǎo)致其重復(fù)性較差;3者的凈化效果依次為乙酸乙酯>乙腈>丙酮。對135種農(nóng)藥及其代謝物在0.1 mg/kg濃度水平下進(jìn)行了添加回收試驗(yàn),圖2顯示,乙酸乙酯無法從含水基質(zhì)中完全萃取出極性較大的農(nóng)藥;與丙酮和乙酸乙酯比較,乙腈適合的農(nóng)藥極性范圍相對廣泛,是一種較為適宜的提取溶劑;3者的提取效率依次為乙腈>丙酮>乙酸乙酯。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。

圖 2 不同溶劑提取當(dāng)歸中135種農(nóng)藥及其代謝物的回收率范圍(n=3)Fig. 2 Recovery ranges of the 135 pesticides and their metabolites in the Angelica sinensis with different extraction solvents (n=3)表 2 采用不同鹽析劑時當(dāng)歸中135種農(nóng)藥及其 代謝物的回收率范圍Table 2 Recovery ranges of the 135 pesticides and their metabolites in the Angelica sinensis with different salting-out agents

Recoveryrange/%NumberofpesticidesandmetabolitesSodiumacetateSodiumchloride<700370-903612890-10011216100-12056>12000

2.3.3 脫水劑與鹽析劑的考察

在提取液中加入硫酸鎂作為脫水劑能有效減小水相的體積,從而促進(jìn)分配于水相的極性分析物再分配進(jìn)入有機(jī)相,以獲得高回收率。但是同時考慮到提取的選擇性,在采用硫酸鎂分離的同時,通過改變添加到樣品中的鹽,可以控制該方法的極性范圍[17],而且可以降低提取溶劑的水溶性,進(jìn)而減小水溶性基質(zhì)成分的共提取、降低基質(zhì)效應(yīng)。常用的鹽析劑有氯化鈉、乙酸鈉等。本文比較了乙酸鈉與氯化鈉的提取效率。結(jié)果顯示,農(nóng)藥在乙酸鈉體系中的回收率普遍高于氯化鈉體系(見表2)。經(jīng)測定,乙酸鈉體系的pH為5～6,而氯化鈉體系的pH為4～5,可見乙酸鈉體系抗基質(zhì)自身酸堿度干擾的能力強(qiáng),有利于農(nóng)藥的穩(wěn)定,尤其是pH敏感型農(nóng)藥,如甲苯氟磺胺、滅螨蜢、咪酰胺等。因此本文采用無水硫酸鎂、乙酸鈉分別作為脫水劑和鹽析劑。

2.3.4 SPE柱的選擇

固相萃取方法中常用的SPE小柱有PSA、NH2、CARB、C18固相萃取柱等。本文考察了不同填料的固相萃取柱對135種農(nóng)藥及其代謝物的提取回收率影響。如圖3所示,使用PSA固相萃取柱時,135種農(nóng)藥及其代謝物的回收率在70%～120%范圍內(nèi)的數(shù)目最多(143個),占總數(shù)的93%。通過凈化后收集液的顏色評價不同小柱的凈化效果,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),凈化效果依次為Florisil>CARB>CARB/NH2>PSA>NH2>C18。Florisil為應(yīng)用最早的填料,由于這種填料會吸附極性強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥,因此不適用于本文的多殘留分析。CARB雖然可有效除去基質(zhì)中大量的色素成分,但不能消除基質(zhì)中的色譜共流出物干擾,不利于減少基質(zhì)噪聲信號[18]。PSA由硅膠鍵合N-丙基-乙二胺得到,有兩個氨基,與NH2柱相似,但比NH2柱具有更強(qiáng)的離子交換能力。因此PSA柱通過極性吸附或弱陰離子交換作用,實(shí)現(xiàn)了對中藥基質(zhì)中的色素、有機(jī)酸、脂肪酸和強(qiáng)陰離子等多種組分的凈化;同時還可以保證農(nóng)藥具有較高的回收率。本文最終采用PSA固相萃取柱凈化。

圖 3 不同固相萃取柱對當(dāng)歸藥材中135種農(nóng)藥及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of the different SPE cartridges on recoveries of the 135 pesticides and their metabolites in the Angelica sinensis (n=3)

2.3.5 洗脫溶劑及洗脫體積的選擇

[19],考察了以乙腈、不同比例的乙腈-甲苯(20∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1, v/v)及不同比例的乙腈-乙酸乙酯(3∶1、5∶1, v/v)作為洗脫溶劑對農(nóng)藥回收率的影響。圖4表明:乙腈-甲苯比例為20∶1時,回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥及代謝物比例最高,占總數(shù)的89%;乙腈為洗脫溶劑時,由于極性較大,共流出干擾物的增多導(dǎo)致農(nóng)藥回收率降低;隨著甲苯比例的增加,洗脫溶劑的極性減小,洗脫能力減弱,使得極性農(nóng)藥(甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果等)不易被完全洗脫;乙酸乙酯作為極性調(diào)節(jié)劑的效果沒有甲苯好。此外,甲苯毒性較大,應(yīng)盡量減少甲苯的添加量。本文同時對洗脫體積(10、15、20、25 mL)進(jìn)行了考察,隨著洗脫體積的增加,135種農(nóng)藥及其代謝物的平均回收率升高,當(dāng)洗脫體積為20 mL時,平均回收率最高,繼續(xù)增加洗脫量,平均回收率沒有顯著變化,而共洗脫出的雜質(zhì)相應(yīng)增多。因此,最終確定采用20 mL乙腈-甲苯(20∶1, v/v)洗脫P(yáng)SA固相萃取柱。

圖 4 不同洗脫溶劑對當(dāng)歸藥材中135種農(nóng)藥及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of the different elution solvents on recoveries of the 135 pesticides and their metabolites in the Angelica sinensis (n=3) A∶T: acetonitrile∶toluene; A∶E: acetonitrile∶ethyl acetate.

2.3.6 濃縮溫度的考察

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),洗脫液的濃縮溫度是影響熱不穩(wěn)定農(nóng)藥回收率的主要因素,如敵百蟲在一定溫度下會降解生成三氯乙醛、磷酸二甲酯和敵敵畏[20];烯草酮為環(huán)己烯酮類除草劑,受熱易被氧化?？疾炝嗽?5、38、40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮對個別農(nóng)藥回收率的影響,結(jié)果表明,40 ℃時,旋蒸時間縮短,但熱不穩(wěn)定農(nóng)藥烯草酮回收率僅44.3%,氨基甲酸酯類農(nóng)藥呋線威的回收率僅51.9%,有機(jī)磷農(nóng)藥磷胺、甲胺磷、敵百蟲回收率分別為65%、63%和69%。在35 ℃和38 ℃下,除烯草酮(回收率66%、63%)外,其余農(nóng)藥回收率均在70%以上。為保證較短的前處理時間,最終采用在38 ℃下旋蒸濃縮。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍與定量限

將1.2節(jié)配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,以各組分定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)對各組分質(zhì)量濃度(x, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用最小二乘法得回歸方程y=a+bx。135種農(nóng)藥及其代謝物在當(dāng)歸藥材基質(zhì)中的響應(yīng)值與其濃度均呈良好的線性關(guān)系,在相應(yīng)的濃度范圍之內(nèi),135種農(nóng)藥及其代謝物的線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

定量限(LOQ)是指在可接受的準(zhǔn)確度和精密度下,能夠定量測定的樣品中待測成分的最低量或濃度[21]。本實(shí)驗(yàn)通過向當(dāng)歸空白基質(zhì)中添加多個較低水平的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn),每個添加水平各平行測定6次,計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),回收率介于70%～120%及RSD小于20%,同時滿足信噪比(S/N)≥10的最低添加水平即該物質(zhì)的定量限。135種農(nóng)藥及其代謝物定量限均在1～10 μg/kg之間,低于各國及組織的法規(guī)對農(nóng)藥殘留限量的要求。最低添加水平下定量稀釋,以信噪比(S/N)≥3時的濃度為檢出限(LOD),為0.3～3 μg/kg。結(jié)果見表3。

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)是指樣品中除分析物以外的組分對分析物的離子化產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制作用,ME影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用以下公式評價ME:

圖 5 135種農(nóng)藥及其代謝物在當(dāng)歸中的基質(zhì)效應(yīng)分布Fig. 5 Distribution of matrix effects of the 135 pesticidesand their metabolites in Angelica Sinensis

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同農(nóng)藥在當(dāng)歸基質(zhì)中的ME不同。如圖5所示,50多個農(nóng)藥在當(dāng)歸藥材中產(chǎn)生明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME<70%)。用以補(bǔ)償ME的方法有:基質(zhì)凈化法、同位素內(nèi)標(biāo)法、空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和加入分析保護(hù)劑等。內(nèi)標(biāo)法不僅可以對ME進(jìn)行校正、保證回收率,而且可對樣品處理過程中的變化進(jìn)行校正,有利于方法的穩(wěn)定性。但對多種類農(nóng)藥同時檢測時,由于存在極性差異,即使是同類物質(zhì)的同位素內(nèi)標(biāo)也很難抵消ME,造成定量結(jié)果偏差。而基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法是按照樣品前處理步驟提取不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品,將提取液作為溶劑,配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。因此,在LC-MS/MS多殘留分析中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線-內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校準(zhǔn)定量能較好地補(bǔ)償ME。

表 3 135種農(nóng)藥及其代謝物的定量限、檢出限、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、加標(biāo)回收率及精密度Table 3 LOQs, LODs, correlation coefficients (r), linear ranges, spiked recoveries and relative standard deviations of the 135 pesticides and their metabolites

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度

本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線-內(nèi)標(biāo)法定量,在無農(nóng)藥殘留的當(dāng)歸空白基質(zhì)中添加135種農(nóng)藥及其代謝物進(jìn)行回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取藥材粉末2 g,置于50 mL離心管中,添加水平分別為10、50和100 μg/kg,按照1.3節(jié)所述的步驟進(jìn)行樣品前處理,每個添加水平重復(fù)6次。3個添加水平下,除了烯草酮回收率偏低(62.0%～68.2%),其余農(nóng)藥的平均回收率為71.3%～119.7%, RSD為1.0%～19.9%,數(shù)據(jù)表明該方法的精密度和回收率都比較好,符合殘留檢測有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。

2.5 定性依據(jù)

參考GB/T 20769-2008,陽性結(jié)果的確證依據(jù)為:樣品中待測物的保留時間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間偏差在±0.2 min以內(nèi);同時樣品中各農(nóng)藥定性離子的相對豐度與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品定性離子的相對豐度必須符合下述標(biāo)準(zhǔn):相對豐度大于50%,偏差在±10%;相對豐度為20%～50%,偏差在±20%;相對豐度小于10%,偏差在±50%。

2.6 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用所建立的分析方法對10批當(dāng)歸樣品進(jìn)行農(nóng)藥的快速篩查。根據(jù)2.5節(jié)所述定性依據(jù),以保留時間、離子對比率進(jìn)行定性分析,以定量離子對進(jìn)行定量分析。在6批藥材中檢出農(nóng)藥殘留,檢出率高達(dá)60%。檢出的農(nóng)藥有多菌靈、甲拌磷、莠去津、烯唑醇,含量依次為0.010～0.020 mg/kg、0.018～0.051 mg/kg、0.012～0.018 mg/kg、0.015～0.049 mg/kg,其中甲拌磷和烯唑醇超出歐盟限量要求(MRL為0.01 mg/kg),但低于CAC的規(guī)定(MRL為0.1 mg/kg)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種類農(nóng)藥在當(dāng)歸藥材中有不同程度的殘留,這可能由于藥材在種植、生產(chǎn)、儲存過程中接觸不同種類農(nóng)藥有關(guān)。

3 結(jié)論

本文建立了當(dāng)歸藥材中135種農(nóng)藥及其代謝物殘留快速檢測的SPE-UFLC-MS/MS方法。該方法操作簡單、凈化效果好、靈敏度高,為當(dāng)歸藥材中多類別農(nóng)藥殘留的例行檢測、風(fēng)險評估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。

參考文獻(xiàn):

[1] Bian J, Chen T X, Chen X R, et al. Acta Prataculturae Sinica (卞靜, 陳泰祥, 陳秀蓉, 等. 草業(yè)學(xué)報(bào)), 2014, 23(6): 266

[2] Kong J, Li J G, Wang J, et al. Journal of Northwest Normal University (孔杰, 李建剛, 王劍, 等. 西北師范學(xué)院學(xué)報(bào)), 1988(3): 50

[3] Cui J J, Song X B, Ma X J, et al. Modern Chinese Medicine (崔建軍, 宋學(xué)斌, 馬曉嘉, 等. 中國現(xiàn)代中藥), 2012, 14(6): 28

[4] Wang L. [MS Dissertation]. Yanji: Yanbian University (王亮. [碩士學(xué)位論文]. 延吉: 延邊大學(xué)), 2007

[5] Zhuang W J. The Global Regulations on Maximum Residue Limits (MRLs) for Pesticides in Foodstuffs and Feedstuffs: Volumes Ⅰ-Ⅳ. Beijing: Chemical Industry Press (莊無忌. 國際食品飼料中農(nóng)藥殘留限量法規(guī): Ⅰ～Ⅳ卷. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社), 2010

[6] GB 2763-2014

[7] Lin W X. The Compilation of Residue Limit Standards for Pesticides and Veterinary Drugs in Foodstuffs in the World. Dalian: Dalian Maritime University Press (林維宣. 各國食品中農(nóng)藥獸藥殘留限量規(guī)定. 大連: 大連海事大學(xué)出版社), 2002

[8] Zhang Y, Zhang Q, Wang X Q. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (張園, 張琦, 王賢親. 藥物分析雜志), 2012, 32(1): 95

[9] Ding M, Zhong D L, Tang F B, et al. Chinese Journal of Chromatography (丁明, 鐘冬蓮, 湯富彬, 等. 色譜), 2013, 31(2): 117

[10] Li N, Shao H, Liu L, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (李娜, 邵輝, 劉磊, 等. 藥物分析雜志), 2012, 32(5): 852

[11] Cheng Z, Zhang R, Liu W H, et al. Chinese Journal of Chromatography (程志, 張蓉, 劉韋華, 等. 色譜), 2014, 32(1): 57

[12] Wang F, Li T, Ma C. Chinese Journal of Chromatography (王菲, 李彤, 馬辰. 色譜), 2013, 31(3): 191

[13] Wang L Z, Zhou Y, Huang X Y, et al. Chinese Journal of Chromatography (王連珠, 周昱, 黃小燕, 等. 色譜), 2013, 31(12): 1167

[14] European Pharmacopeial Convention. European Pharmacopoeia 7.0. (2012-06-01). http://db.yaozh.com/foreign/EP7.0/20813E.PDF

[15] The United Stated Pharmacopeial Convention. United States Pharmacopeia 34. (2011-04-24). http://ishare.iask.sina.com.cn/f/14853792.html

[16] European Commission Decision 2002/657/EC

[17] Mei T, Wu R S, Wei B. China Fruit Vegetable (梅婷, 吳榮順, 魏波. 中國果菜), 2014, 34(2): 62

[18] Wang Y J, Huang H L, Zhuo H H, et al. Journal of Inspection and Quarantine (王玉健, 黃惠玲, 卓海華, 等. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊), 2009, 19(2): 74

[19] Jin C L. [MS Dissertation]. Baoding: Hebei University (金春麗. [碩士學(xué)位論文]. 保定: 河北大學(xué)), 2012

[20] Yu H J, Cai Y Q, Li Q, et al. Chinese Journal of Chromatography (于惠娟, 蔡友瓊, 李慶, 等. 色譜), 2006, 24(1): 23

[21] Wang J H, Xu W Y, Sun L, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (王京輝, 許瑋儀, 孫磊, 等. 藥物分析雜志), 2012, 32(9): 1704

Determination of 135 pesticides and their metabolites inAngelicasinensisby ultra-fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid-phase extraction

LIU Jie1, TONG Ling2, MENG Wenting2, ZHAO Yunli1, YU Zhiguo1*

(1.SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.PharmaceuticalAnalysisInstitute,TaslyHoldingGroupAcademy,Tianjin300402,China)

A method using solid-phase extraction (SPE) followed by ultra-fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS) has been established for simultaneously quantitative determination of 135 pesticides and their metabolites (organophosphorus pesticides, pyrethroid pesticides and carbamate pesticides, etc.) inAngelicasinensis. The pesticide residues were extracted from the samples by acetonitrile, cleaned-up with a primary secondary amine (PSA) column and then analyzed using UFLC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode with positive electrospray ionization. The pesticide residues were quantified by matrix matched standard solution-internal standard method. All of the pesticides had good linear responses withr>0.99. The average recoveries of the pesticides at the spiked levels of 10, 50, 100 μg/kg ranged from 71.3%-119.7% with the RSDs of 1.0%-19.9%, except for clethodim (62.0%-68.2%). The limits of quantification of the 135 pesticides and their metabolites were 1.0-10.0 μg/kg. The results demonstrated that the method is simple, fast, sensitive and can be used for the analysis of the multiclass of pesticide residues inAngelicasinensis.

ultra-fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS); solid-phase extraction (SPE); multiclass of pesticide residues and metabolites;Angelicasinensis

10.3724/SP.J.1123.2015.09014

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2013ZX09402202).

2015-09-14

O658

A

1000-8713(2015)12-1257-12

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(024)23986295,E-mail:zhiguo-yu@163.com.