西安交通大學(xué)(西安710061)

雷 秦△ 王夢昌 王 娟

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·論著·基礎(chǔ)研究·

苦參堿對NK細(xì)胞殺傷HL60細(xì)胞的影響及其機制研究*

西安交通大學(xué)(西安710061)

雷 秦△王夢昌 王 娟

目的：探討苦參堿對NK細(xì)胞殺傷急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60的影響及作用機制。方法：實時定量PCR(qRT-PCR)檢測苦參堿處理前后HL60細(xì)胞表面NK細(xì)胞活化性受體凝集素樣同型二聚體(NKG2D)配體分子MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3 表達情況，CFSE染色流式法檢測苦參堿作用前后HL60細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷敏感性的改變。結(jié)果：qRT-PCR結(jié)果表明1.0 mg/ml苦參堿處理HL60細(xì)胞24h后HL60細(xì)胞表面MICA和ULBP2表達水平較正常對照組分別增加2.34倍和2.86倍，而MICB、ULBP1和ULBP3與處理前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；處理48h后HL60細(xì)胞表面MICA/B、ULBP1/2/3表達水平較處理前均有不同程度升高，尤以ULBP2和ULBP3升高最明顯，較正常對照組分別增加了3.74倍和3.22倍。CFSE染色流式數(shù)據(jù)顯示效靶比例5∶1和10∶1條件下，苦參堿均可加強NK細(xì)胞對HL60細(xì)胞的殺傷效率。結(jié)論：苦參堿可促進HL60細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷敏感性，其機制與誘導(dǎo)HL60細(xì)胞表面NKG2D配體表達上調(diào)密切相關(guān)。

自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK)是機體非特異性免疫的主要免疫細(xì)胞,組成了機體抗腫瘤的第一道防線[1]。NK細(xì)胞的殺傷活性主要受其活化性受體和抑制性受體的共同調(diào)節(jié)[2]?？鄥A(Matrine,MT)是傳統(tǒng)中藥苦參的主要有效成分,研究表明MT對肝癌、肺癌、胃癌、膽管癌、腸癌、黑色素瘤等多種實體腫瘤均具有顯著的抗癌作用[3-4]。然而目前關(guān)于苦參堿在白血病中的防治作用報道較少。本研究旨在探討苦參堿對NK細(xì)胞殺傷急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60的活性影響,并探討其作用機制。

材料和方法

1 實驗材料 HL60細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,人自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)購自上海博谷生物科技有限公司?？鄥A購自美國Sigma公司,純度>98%,配置儲存液濃度為10 mg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)所需的胎牛血清、馬血清、RPMI 1640 及α-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司產(chǎn)品；Fast 200總RNA急速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mix及qRT-PCR引物購自大連TaKaRa公司；CellTraceTMCFSE細(xì)胞增殖檢測試劑盒(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit)購自美國Invitrogen公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) HL60細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中,于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分組培養(yǎng)及傳代，細(xì)胞密度維持在1×106/ml。NK細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含1.5 g/L碳酸氫鈉、12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM。根據(jù)細(xì)胞密度，每隔3～5d換液或傳代。

3 藥物處理及分組 收集對數(shù)生長期的HL60細(xì)胞,接種于6孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml,每孔2 ml。實驗組加入苦參堿,使其終濃度為1.0 mg/ml,陰性對照組加人等體積RPMI 1640培養(yǎng)基,正常對照組不作特殊處理。各組細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24和48 h，收集細(xì)胞進行后續(xù)分析。

4 qRT-PCR檢測苦參堿作用前后HL60細(xì)胞表面NKG2D配體表達水平 按照Fast 200總RNA抽提試劑盒操作說明分別提取各組細(xì)胞總RNA,酶標(biāo)儀測定吸光度值,計算A260/A280驗證RNA純度和RNA濃度。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,產(chǎn)物行qRT-PCR,以GAPDH為內(nèi)源性對照。引物序列和擴增目的條帶大小如表1所示。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min,95℃變性30s,60℃退火延伸30s,72℃延伸1 min,共進行40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)源性參照計算目的基因相對表達水平。

表1 NKG2D配體及內(nèi)參基因qRT-PCR引物序列

5 CellTraceTMCFSE流式法檢測苦參堿作用前后HL60細(xì)胞增殖 收集各組細(xì)胞，離心去上清后重懸于PBS，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。每毫升細(xì)胞懸液中加入2μl CFSE貯存液(終濃度為10μmol/L)。輕輕吹打混勻，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育30min后加入5～10倍體積4℃預(yù)冷的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，終止染色。冰上繼續(xù)孵育5 min，4℃離心棄上清，新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。將標(biāo)記好的HL60細(xì)胞與NK細(xì)胞按不同效靶比(5∶1和10∶1)輕輕混勻，培養(yǎng)箱中孵育4 h后收集細(xì)胞，流式緩沖液洗滌細(xì)胞2次并重懸，加入50μg/ml PI，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機檢測CFSE+PI+HL60細(xì)胞百分率。

結(jié) 果

1 苦參堿對HL60細(xì)胞表面NKG2D配體表達水平的影響 QRT-PCR結(jié)果表明，苦參堿處理前HL60細(xì)胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP 3 mRNA表達均為陽性，且ULBP1、ULBP2和ULBP3表達水平整體明顯高于MICA和MICB。1.0 mg/ml苦參堿處理24 h后HL60細(xì)胞表面MICA和ULBP2表達水平較正常對照組分別增加2.34倍和2.86倍，而MICB、ULBP1和ULBP3與處理前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。處理48h后HL60細(xì)胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3表達水平較處理前均有不同程度升高，尤以ULBP2和ULBP3升高最明顯，較處理前分別增加了3.74倍和3.22倍(P<0.05)(見圖1)。

圖1 苦參堿對HL60細(xì)胞表面NKG2D配體分子表達水平的影響

2 苦參堿對NK細(xì)胞殺傷HL60細(xì)胞效應(yīng)的影響 當(dāng)效靶比為5∶1時，NK細(xì)胞對經(jīng)1.0 mg/ml苦參堿預(yù)處理24h和48h后的HL60細(xì)胞的殺傷率分別為32.88%和40.26%，較處理前(25.42%)增加；當(dāng)效靶比為10∶1時，NK細(xì)胞對經(jīng)1.0 mg/ml苦參堿預(yù)處理24 h和48 h后的HL60細(xì)胞的殺傷率分別為52.45%和62.12%，較處理前(43.96%)顯著增高(P<0.05)(見圖2)。上述結(jié)果說明苦參堿可增強HL60細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性。

圖2 苦參堿對NK細(xì)胞殺傷HL60細(xì)胞效應(yīng)的影響

討 論

急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓細(xì)胞白血病的一種特殊類型,15號染色體和17號染色體分別發(fā)生斷裂、易位形成PML-RARα融合基因,并表達融合蛋白是其特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)表現(xiàn)[5]。目前APL的治療主要依靠全反式維甲酸誘導(dǎo)分化治療,然而日益增多的耐藥病例出現(xiàn)和嚴(yán)重的維甲酸綜合癥使得為復(fù)發(fā)和難治性APL患者尋求新的治療途徑迫在眉睫。

苦參作為傳統(tǒng)中藥,其藥用歷史已有數(shù)千年,苦參堿是其主要有效成分[6]。臨床實驗表明苦參堿具有多種藥理作用,包括抗肝損傷、抗心血管疾病、抗病毒、升高白細(xì)胞等,其中尤以其抗腫瘤作用最為引人關(guān)注[7]。Zhang等[8]研究表明通過對肝癌大鼠模型腹腔注射苦參堿可顯著減少肝臟表面癌結(jié)節(jié)數(shù)及血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平，體外實驗結(jié)果也證實苦參堿可顯著抑制多種肝癌細(xì)胞增殖。不僅如此，苦參堿還可抑制肺癌A549和SPC-A-1細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡[9]。此外,研究還表明苦參堿處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞后可增加G0/G1期細(xì)胞所占百分比，降低S期和G2/M期細(xì)胞百分比,提示苦參堿還可影響腫瘤細(xì)胞周期[10]。盡管目前關(guān)于苦參堿的抗腫瘤作用已有較多報道,但多集中在實體腫瘤,苦參堿對白血病的治療作用仍有待于進一步探討。

NK細(xì)胞因其具有非MHC限制性殺傷腫瘤細(xì)胞的優(yōu)點,故在腫瘤早期免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用。NK細(xì)胞的殺傷活性主要受其激活性受體和抑制性受體的共同調(diào)節(jié)及相互間作用來平衡，其中活化性受體NKG2D介導(dǎo)的活化信號對NK細(xì)胞激活和殺傷作用發(fā)揮起關(guān)鍵作用[11]。NKG2D通過與其配體相互作用向NK細(xì)胞傳遞活化信號，進一步激活NK細(xì)胞，使其獲得攻擊靶細(xì)胞的能力。靶細(xì)胞表面NKG2D配體的表達水平與NKG2D的活性密切相關(guān)[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，苦參堿處理HL60細(xì)胞24h后MICA和ULBP2表達水平增加，而MICB、ULBP1和ULBP3表達與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；處理48h后5種NKG2D配體MICA/B、ULBP1/2/3表達水平與正常對照組相比均顯著增加，同時流式細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示NK細(xì)胞對HL60細(xì)胞的殺傷效率隨著苦參堿預(yù)處理時間延長逐漸增強。綜上所述，我們認(rèn)為苦參堿可顯著提高急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60對NK細(xì)胞殺傷的敏感性，其作用機制與誘導(dǎo)細(xì)胞表面NKG2D配體表達密切相關(guān)。

[1] Johnston MF,Ortiz SE,Vujanovic NL,etal.Acupuncture May Stimulate Anticancer Immunity via Activation of Natural Killer Cells[J].Evid Based Complement Alternat Med,2011,2011：481625.

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(收稿：2015-03-02)

Influence of killing efficiency of NK on HL60 cell line by matrine and molecular mechanisms

Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Lei Qin Wang Mengchang Wang Juan

Objective：To explore the influence of killing efficiency of natural killer cell(NK)on HL60 cell line by matrine and investigate its underlying molecular mechanism. Methods：The expression of NKG2D ligands(major histocompatibility complex class I chain-related molecule A or B (MICA/B),UL16- binding proteins(ULBP)1,2,and 3 on HL60 cells were analyzed before and after treated with matrine by quantitive real-time PCR(qRT-PCR).The cytotoxic sensitivity of HL60 to NK cell was detected by FCM after CFSE staining at different effect-to-target (E/T) cell ratios. Results：After treatment with matrine for 24h,MICA and ULBP2 expression on HL60 cells were significantly increased, however, there was no statistically significant difference between MICB, ULBP1/3 expression and normal control group. After treatment with matrine for 48h,the expression of MICA/B,ULBP1/2/3 were increased inordinately. Flow cytometry results showed that at the ratio of E/T with whether 5∶1 or 10∶1,the proportion of the killed HL60 cells were increased by matrine treatment. Conclusion：Matrine can promote the killing efficiency of NK on HL60 cell line, which is closely related to up-regulation of NKG2D ligands.

Matrine Leukemia,promyelocytic,acute Receptors,natural killer cell @HL60 @NKG2D ligands

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81071952)

苦參堿 白血病,早幼粒細(xì)胞,急性 受體,自然殺傷細(xì)胞 @HL60細(xì)胞 @NKG2D配體

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.001

△陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院血液科