于自民 鮑玉芳 何召慶/中國動物保健品有限公司

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豬繁殖與呼吸綜合征實驗室檢測方法研究進展

于自民 鮑玉芳 何召慶/中國動物保健品有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱“藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，主要侵害不同日齡、品種豬的呼吸和生殖系統(tǒng)，在發(fā)病過程中表現(xiàn)為仔豬斷奶前高死亡率、育成豬呼吸困難、母豬繁殖障礙為特征的高度接觸性病毒傳染病，近年來已成為嚴重危害全球養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的疾病之一。PRRSV感染引起的病毒血癥、持續(xù)感染等，對我國養(yǎng)豬業(yè)疫病防控構(gòu)成威脅并造成慘重的經(jīng)濟損失，目前是影響我國養(yǎng)豬業(yè)最重要疫病之一。本文擬對該病的實驗室檢測方法進行歸納總結(jié)，以利于快速準(zhǔn)確地診斷該病。

一、PRRS概述

PRRS是豬“高熱綜合征”的主要疫病之一，屬于免疫抑制性疾病，常常引起繼發(fā)感染，造成免疫失敗等。因此國際獸疫局將其列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。20世紀(jì)80年代末美國南部首次報道了PRRSV，隨后在德國、加拿大、荷蘭一些國家廣泛傳播。由于起初不清楚何種病原體引起，根據(jù)臨床上斷奶仔豬呼吸困難、嚴重肺炎、生產(chǎn)性能下降、母豬嚴重的繁殖障礙等，稱之為“豬流行性和呼吸道綜合征”、“豬藍耳病”、“豬神秘病”等。1991年荷蘭學(xué)者Wensvoort等用豬肺泡巨噬細胞（PAM）首次分離病毒（LV株），1992年美國學(xué)者分離到VR-2332株病毒。1995年我國北京地區(qū)暴發(fā)PRRS，隨后類似PRRS疾病蔓延到華東、華北等地區(qū)，1996年經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定為PRRSV感染。2006年夏以來我國又暴發(fā)了以變異美洲型病毒（JX-A1為代表的Nsp2缺失）為病原的高致病性藍耳病，據(jù)初步統(tǒng)計，豬感染PRRSV的發(fā)病率達50% 以上，死亡率20%～100%。分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2006-2008年高致病性PRRSV毒株占國內(nèi)流行株的78%，2009年占86%，2010-2011年占88.9%，加重了許多地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟負擔(dān)。

二、PRRSV病原學(xué)特性及主要結(jié)構(gòu)蛋白

PRRSV屬于動脈炎病毒科有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因全長約15Kb，包含9個彼此重疊的開放閱讀框（ORF）。PRRSV根據(jù)基因遺傳變異分為北美洲型（VR-2332）和歐洲型（LeLystad）兩種基因型毒株。盡管LV和VR-2332毒株幾乎同時出現(xiàn)，且病理癥狀相似，但它們的遺傳特性和抗原之間差異很大，歐洲型LV株和北美型VR-2332株的PRRSV基因組序列的差異達40%左右。PRRSV不同毒株間的致病力和毒力有明顯的差異，目前我國主要流行的是美洲型PRRSV分離株，并在不斷的變異。PRRSV的主要病毒粒子成分是蛋白質(zhì)，其中GP5、M、N蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，GP5蛋白是由ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白，又稱E蛋白，具有受體識別作用，是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中產(chǎn)生中和抗體最強的結(jié)構(gòu)蛋白；M蛋白為膜基質(zhì)蛋白，遺傳方面最為保守，在病毒感染的早期有很重要的作用；N蛋白由ORF7編碼，為核衣殼蛋白，在感染細胞中的表達水平較高且抗原性較好，一般作為診斷分析的理想靶位。對感染的PRRSV通過對E、M、N三種主要結(jié)構(gòu)蛋白的抗體檢測表明，檢測到的抗體出現(xiàn)順序依次為N、M、E蛋白抗體。

三、PRRS實驗室常用診斷方法

PRRSV沒有特異性的病理變化，易和其他疫病混合感染，很難確診。所以PRRSV疑似病例必須通過臨床癥狀、病例剖檢初步診斷并結(jié)合實驗室檢測進行確診。目前實驗室常用的檢測方法有：病毒分離（VI）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、熒光定量PCR、血清中和實驗（SN） 、免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等。

1.病毒分離。目前VI是診斷PRRSV最準(zhǔn)確、最經(jīng)典的方法。PRRSV的分布在豬體內(nèi)隨著PRRSV感染豬的階段（急性感染期、康復(fù)期、持續(xù)感染期）而變化，一般在急性感染期，多采集血、肺樣品較好，而在持續(xù)感染期采集口鼻棉拭及肺樣品較好。病毒分離成功的關(guān)鍵是選取病毒含量最高的臨床樣品，盡量新鮮病樣及時送檢。PRRSV病毒分離常用豬原代肺泡巨噬細胞（PAM)，其中大多數(shù)歐洲毒株均可適應(yīng)于PMA細胞。初次分離時，高致病性PRRSV一代便可適應(yīng)Marc-145細胞并出現(xiàn)細胞聚集、固縮和脫落等典型病變，且分離成功率較高，而經(jīng)典毒株P(guān)RRSV，一般需要先適應(yīng)PAM細胞后，才能適應(yīng)Marc-145細胞，且不易出現(xiàn)病變。對于在敏感細胞上不產(chǎn)生病變的細胞還需要結(jié)合實驗室其他診斷方法（ELISA、RT-PCR、IFA）進一步鑒定。用病毒分離培養(yǎng)方法檢測PRRSV耗時時間較長、操作繁瑣等缺點，不適用于大規(guī)模的檢測。VI是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的PRRS的診斷方法，多用于急性病例的確診。

2.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)。分子生物學(xué)技術(shù)主要包括RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR等技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是實驗室檢測PRRSV RNA的一種敏感技術(shù)，該法不用細胞分離培養(yǎng)病毒，避免了交叉污染的風(fēng)險，檢測所需的時間也大大縮短，并且具有較高的敏感性和特異性，是臨床上廣泛應(yīng)用診斷PRRSV的方法。RT-PCR檢測方法的原理是針對PRRSV的 ORF7、ORF6和ORF1b的基因序列設(shè)計引物。1997 年S.A.Gilbert等依據(jù)ORF1b的保守序列設(shè)計引物，建立了同時鑒定美洲型和歐洲型PRRSV的多重RT-PCR和套式多重RT-PCR。2005年Kleiboeker等依據(jù)ORF7和 3’末端非編碼區(qū)的保守序列設(shè)計引物及探針，建立了鑒別、定量、多重檢測美洲型和歐洲型PRRSV的實時熒光定量RT-PCR法。我國農(nóng)業(yè)部動物檢疫所依據(jù)ORF7、ORF6保守序列設(shè)計引物建立檢測PRRSV美洲型的套式RT -PCR檢測試劑盒。2008年Xiao等參照GeneBank PRRSV的Nsp2基因，利用HPPRRSV在NSP2基因出現(xiàn)特征性的不連續(xù)的30個氨基酸（90個堿基）的缺失，針對NSP2設(shè)計引物，建立了快速診斷高致病性PRRSV的實時熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)，來區(qū)分高致病性藍耳病毒和經(jīng)典北美型藍耳病毒。與常規(guī)的RT-PCR方法相比，該法設(shè)計了熒光探針，增強了檢測的特異性，具有操作方便、結(jié)果直觀、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，有廣泛的應(yīng)用前景。

3.血清中和試驗。SN在PRRS抗體檢測中特異性高，可用于免疫效果的評價。SN檢測時抗體比IFA出現(xiàn)晚，而不適宜于急性感染性的抗體。SN在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的方法都要以此為標(biāo)準(zhǔn)進行比較。本法操作復(fù)雜，僅限于實驗室研究應(yīng)用，不適合大規(guī)模推廣適用。SN是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用于檢測PRRS病毒抗體的方法。

4.免疫過氧化酶單層細胞試驗。IPMA于1994年由荷蘭中央獸醫(yī)研究所建立，是最早問世的檢測PRRS抗體的血清學(xué)方法。該法主要在CL-2621及Marc-l45培養(yǎng)物上進行，可用于PRRSV的抗原檢測、病毒鑒定及早期血清抗體檢測。IPMA能從感染后7～15 d的豬體中檢測到PRRS抗體，敏感性和特異性較好。IPMA的不足之處是實驗結(jié)果可能受實驗毒株和感染野毒株相關(guān)性的影響，且IPMA的檢測結(jié)果需要用肉眼判斷，存在一定的主觀性。IPMA是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用于檢測PRRS抗體的方法，多用于確定病性而不易區(qū)分病毒的抗原類型。

5.間接免疫熒光抗體試驗。IFA是應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理及異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記二抗，建立檢測PRRSV抗體的方法。1992年由美國Yoon等首次建立IFA，該法具有較好的敏感性和特異性，已廣泛應(yīng)用于北美實際檢測中。1996年我國哈爾濱獸醫(yī)研究所首次建立了IFA的檢測方法。1997年孫穎杰等報道建立了微量IFA法檢測PRRSV抗體，和美國的玻片IFA特異性敏感性相同，符合率達到100%。針對臨床上新近感染PRRSV的樣品易使用IFA試驗，操作快速簡單，檢測成本低，與IPMA具有相同的特異性和敏感性。IFA是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用于檢測PRRS的病毒抗體的方法，在許多國家都得到了廣泛應(yīng)用，已成為各國官方認可的檢測方法之一。

6.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗。間接ELISA主要用于檢測動物感染PRSSV之后的抗體水平。1992年國外學(xué)者Albnia等應(yīng)用PAM細胞培養(yǎng)制備病毒抗原，首次建立了檢測PRRVS抗體的間接ELISA。1996年Takikawa等用PRRSV接種Marc-145制備抗原，改進了檢測PRRSV抗體的ELISA方法，我國也在1996年建立了ELISA檢測方法。國內(nèi)外學(xué)者在PRRSV 抗體ELISA 試劑盒的研發(fā)上做了大量研究，已有用核衣殼蛋白（N蛋白）或用膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作為主要包被抗原檢測PRRSV抗體的間接ELISA試劑盒面世。國外的ELISA試劑盒具有良好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，常被一些權(quán)威部門用于PRRS抗體檢測，由于此類產(chǎn)品價格昂貴，限制了在臨床上的應(yīng)用。國內(nèi)學(xué)者研發(fā)的PRRS抗體檢測試劑盒在靈敏度和試劑盒保存條件等方面還有待提高。2006年吳延功等以純化的重組N蛋白為包被抗原，建立PRRSV的檢測方法，同時使用國外的試劑盒對899份樣品進行檢測，結(jié)果表明兩種方法的符合率是91.73%。ELISA方法因具備穩(wěn)定性好、抗原用量少、特異性強、結(jié)果便于長期保存等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于PRRSV樣品的臨床檢測，但存在出現(xiàn)假陽性結(jié)果的缺點。間接ELISA是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用于檢測PRRS抗體的方法，和IFA、IPMA的特異性相似，但以間接ELISA的的敏感性最高。

四、PRRSV實驗室檢測時要注意的事項

正確選擇樣品及時送檢，采集的樣品最好是處于急性感染期，后期采集的樣品易產(chǎn)生陰性或可疑結(jié)果；血清學(xué)結(jié)果的判定要慎重，因一部分注射疫苗的豬體內(nèi)可以檢測到病毒，診斷時需要了解豬群的發(fā)病史和疫苗接種時間；診斷PRRSV時最好是抗原和抗體檢測法相結(jié)合，因血清學(xué)方法無法確定豬群感染的時間，無法區(qū)分血清學(xué)的陽性結(jié)果是由于野毒感染還是接種疫苗所引起；進行病毒分離和RNA檢測的樣品，必須在采集后立即冷藏保存并在2 d內(nèi)送往診斷實驗室，避免反復(fù)凍融。

五、PRRSV實驗室診斷方法的優(yōu)劣

當(dāng)前我國豬群中PRRSV的感染率呈逐年上升的趨勢，PRRSV的多樣性、復(fù)雜性加大了該病毒防控的難度。因PRRSV幾乎不能從根本上消除，所以重點應(yīng)放在加強對PRRSV檢測和防治上。上述幾種PRRSV實驗室檢測方法中，分子生物技術(shù)敏感性高，特異性強，快速簡便，是目前應(yīng)用較廣泛的PRRSV檢測技術(shù)。IFA、IPMA、SN等技術(shù)需要細胞培養(yǎng)、工作量大，多用于科研。ELISA是具有特異性高、一次檢測樣品多、敏感性強，檢測速度快等優(yōu)點，是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測技術(shù)，適合大規(guī)模流行病調(diào)查和大批樣品的檢測，所以很多國家都將其列為標(biāo)準(zhǔn)的操作方法。

總之，PRRSV的流行現(xiàn)狀給疾病診斷帶來了巨大的挑戰(zhàn)，在實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的需要選擇合適的診斷方法。一般VI、SN、IFA和IPMA不適于實際生產(chǎn)推廣和應(yīng)用，分子生物學(xué)診斷技術(shù)RT-PCR更受實驗室的青睞，間接ELISA的靈敏度高、特異性強，多用于PRRS的臨床診斷。

參考文獻圖（略）