魏林，梁志懷，張屹，肖姬玲，呂剛，3

（1.湖南省植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省西瓜甜瓜研究所；3.中南大學(xué)研究生院隆平分院）

1 水生蔬菜真菌病害癥狀觀察和發(fā)病程度調(diào)查方法

1.1 癥狀觀察

在田間對(duì)目標(biāo)水生蔬菜真菌病害進(jìn)行癥狀觀察時(shí)，都遵循方中達(dá)先生所述的先片后點(diǎn)的原則。即先觀察病害在全田發(fā)生的普遍性和嚴(yán)重度，病害發(fā)生的中心區(qū)及在田間發(fā)展分布，發(fā)生時(shí)期以及植株受害部位；然后觀察病害對(duì)整個(gè)植株的為害情況，包括是否出現(xiàn)腐爛、萎蔫、萎縮、畸形及生長(zhǎng)習(xí)性的改變等；最后觀察出現(xiàn)典型癥狀的部位。

在針對(duì)由真菌所引起的水生蔬菜的葉斑病和斑點(diǎn)病等，調(diào)查時(shí)除觀察病斑形狀、大小、顏色、受害部分正反面（如葉面及葉背）癥狀、病斑上是否出現(xiàn)霉?fàn)钗锘蛐『邳c(diǎn)或輪紋等孢子和子實(shí)體病征外，還需留意癥狀初始狀態(tài)，及至發(fā)病后期的癥狀。本文采用的方法是發(fā)現(xiàn)初始癥狀后，定點(diǎn)固定幾片葉，掛上標(biāo)簽。隨后的一段時(shí)期，定時(shí)定點(diǎn)觀察病害在葉片上癥狀發(fā)展情況，這樣做既確定了該病害發(fā)生后期的為害癥狀，又獲得了該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

1.2 發(fā)病程度調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、病原菌致病性等級(jí)及品種抗性等級(jí)的劃分

在水生蔬菜葉部病害發(fā)生程度調(diào)查、室內(nèi)人工接種病原菌測(cè)定其致病性和寄主抗病性，以及對(duì)水生蔬菜各真菌性葉斑病等病害進(jìn)行田間藥劑防治試驗(yàn)時(shí)，都需要一個(gè)病害調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)各病害的發(fā)生特點(diǎn)，制定了相應(yīng)的田間葉部病害調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，室內(nèi)菌絲塊人工接種時(shí)藕塊發(fā)病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以及蓮藕腐敗病實(shí)生苗人工接種發(fā)病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)際應(yīng)用表明，所制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可以很好的區(qū)分植株的受害程度，進(jìn)而鑒定出病原菌菌株間致病性的差異及寄主間抗病性的差異。具體的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下。

①發(fā)病程度調(diào)查的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 在田間進(jìn)行蓮藕葉部病害發(fā)生程度及田間藥效防治試驗(yàn)時(shí)，制定的調(diào)查葉片發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí):葉片無(wú)病斑；1 級(jí)：病斑面積占整片葉面積的10%以下；3 級(jí)：病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5 級(jí)：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7 級(jí)：病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9 級(jí)：病斑面積占整片葉面積的75%以上。

②病原菌致病性等級(jí)劃分 在接種新鮮藕塊依據(jù)發(fā)病藕塊的病情程度來(lái)判斷蓮藕腐敗病菌和不同菌株的致病力強(qiáng)弱時(shí)，制定的調(diào)查藕塊發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)：藕塊生長(zhǎng)正常、完好；1 級(jí)：藕塊表面有輕微病變，病變尚未侵及藕塊體內(nèi)組織；2 級(jí)：藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3 級(jí)：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%以下；4 級(jí)：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%～30%；5 級(jí)：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的30%以上，每個(gè)藕塊為一計(jì)量單位。依據(jù)調(diào)查分級(jí)的結(jié)果，計(jì)算病情指數(shù)：病情指數(shù)=∑（各級(jí)藕塊數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總藕塊數(shù)×5）×100；再依據(jù)病情指數(shù)，按如下等級(jí)劃分腐敗病病原菌致病力的強(qiáng)弱：病情指數(shù)＞70，表示強(qiáng)致病力；30≤病情指數(shù)≤70，表示中致病力；病情指數(shù)＜30，表示弱致病力；病情指數(shù)為0，表示無(wú)致病力。

③品種抗性等級(jí)劃分 在進(jìn)行蓮藕腐敗病實(shí)生苗人工接種測(cè)定品種抗病性時(shí)，制定的調(diào)查葉片發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)：植株葉片未見(jiàn)任何發(fā)病癥狀；1 級(jí)：葉片僅葉緣出現(xiàn)零星病斑，病斑面積不超過(guò)葉該葉片總面積的5%；2 級(jí)： 病斑沿葉緣連片，并向葉片中心發(fā)展，病斑面積占該葉片總面積的5%～20%；3 級(jí)：病斑面積占該葉片總面積的21%～40%；4 級(jí)：病斑面積占該葉片總面積的41%～60%；5 級(jí)：病斑面積占該葉片總面積的61%～80%；6 級(jí)：病斑面積占該葉片總面積的81%～100%，葉片褐腐死亡。蓮不同品種對(duì)腐敗病的抗性評(píng)價(jià)根據(jù)病情指數(shù)分成6 個(gè)等級(jí)：高抗≤10；10＜抗病≤20；20＜中抗≤40；40＜中感≤60；60＜感病≤80；80＜高感≤100。

2 病原菌菌絲體和子實(shí)體直接鏡檢的方法

由病原真菌引起的水生蔬菜病害，在其發(fā)病部位會(huì)有明顯的病征，可以利用這一點(diǎn)，在田間應(yīng)用放大鏡、 室內(nèi)應(yīng)用顯微鏡在分離病原物前進(jìn)行檢查，觀察植株發(fā)病部位附著的真菌菌絲體和其他營(yíng)養(yǎng)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)和著生方式、子實(shí)體形態(tài)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生部位等，從而對(duì)病原物先有初步的了解。在此過(guò)程中，常用的方法有3 種。

①當(dāng)植株發(fā)病部位出現(xiàn)明顯的黑點(diǎn)（孢子體）、菌絲體、菌核等病征時(shí)，最簡(jiǎn)單的方法就是接種針直接挑取這些特征物，放在加有一滴無(wú)菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。

②當(dāng)植株發(fā)病部位出現(xiàn)的是如黑粉、白粉和其他霉?fàn)钗飼r(shí)，則可以用小片透明膠帶，貼在這些真菌體的部位，然后將沾有真菌的膠帶放在載玻片上，于顯微鏡下觀察。

③對(duì)于由鏈格孢或子囊菌等引起的病征十分明顯的病害，還可以用尖細(xì)的鑷子撕取透明的小塊受害部位寄主組織，直接放在載玻片上于顯微鏡下觀察。

3 病害病原菌單孢純化培養(yǎng)方法

蓮藕、茭白等水生蔬菜真菌病害的病原菌，在普通的PDA 培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力均較強(qiáng)。利用這一特點(diǎn)，可以應(yīng)用簡(jiǎn)易的稀釋涂板挑單孢，對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行純化。具體操作是：將病組織分離獲得微生物，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至大量產(chǎn)孢，在無(wú)菌條件下，挑取0.5 cm×0.5 cm 的菌絲塊，放置裝有1 mL無(wú)菌水的離心管中，搖動(dòng)片刻后，再吸取100 μL 轉(zhuǎn)至下一離心管中，然后用稀釋到適宜濃度的離心管中的孢子懸浮液進(jìn)行PDA 平板涂布，可獲得分離度很好的單孢菌落群。

4 用科赫氏法則驗(yàn)證病原菌的方法

4.1 病原菌鑒定的回接方法

對(duì)病原菌進(jìn)行確定時(shí)，遵循科赫氏法則，需進(jìn)行回接驗(yàn)證。回接時(shí)的接種方法，因病原菌侵染的部位不同也有所不同。在對(duì)蓮藕腐敗病病原菌進(jìn)行研究時(shí)，篩選強(qiáng)致病性菌株時(shí)，選取的是新鮮藕塊接種方法：經(jīng)過(guò)分離純化和分子鑒定的供試鐮刀菌菌株用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6 d，取嫩藕節(jié)6～8 cm長(zhǎng)的中間段，縱剖切取獲得用于接種的藕塊；用直徑為5～7 mm 無(wú)菌打孔器自菌落的邊緣打取菌餅，菌餅置于藕塊的中央，菌絲體面朝下，每個(gè)藕塊均勻接種2 個(gè)鐮刀菌菌餅，然后將裝有接種藕塊的發(fā)芽盒放置于24～26℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)；然后按照1.2 的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查和分級(jí)確定。

在篩選蓮抗腐敗病品種研究時(shí)，除選用篩選出的強(qiáng)致病性菌株接種菌株外，采用的實(shí)生苗蘸根接種，即將破口的蓮籽浸在滅菌水中，24～26℃條件下催芽，每天換水1 次。待蓮籽萌發(fā)長(zhǎng)出直立的幼葉、生根3～5 條時(shí)，接種蓮腐敗病病原菌。蓮腐敗病病原菌在超凈工作臺(tái)上按以下操作進(jìn)行接種：將每條根在距根尖0.5 cm 處剪斷，以造成根系的微傷口，然后將整個(gè)根系浸入由無(wú)菌水調(diào)節(jié)的含105～106個(gè)孢子/mL 蓮腐敗病病原菌懸浮液中20～40 min。將接種后的實(shí)生苗移栽于盆缽中栽培，接種至少20 d后，按照1.2 中所列病害評(píng)價(jià)等級(jí)對(duì)葉片進(jìn)行病害等級(jí)鑒定，鑒定后計(jì)算病情指數(shù)，確定籽蓮品種對(duì)腐敗病的抗病性類型。

對(duì)于各種葉部病害的接種，比較了孢子懸浮液接種和菌絲塊接種2 種方法后，采用的是菌絲塊接種：先將待接種的健康幼嫩、無(wú)任何斑點(diǎn)和褪綠癥狀的盆栽蓮藕葉片接種部位用無(wú)菌水擦拭干凈，然后將分離純化的病菌菌絲塊以針刺法接種于該部位，并用蘸水的無(wú)菌脫脂棉保濕，一般24 h 后接種部位就可出現(xiàn)不同的表型。

4.2 病原菌再分離方法的簡(jiǎn)化

當(dāng)應(yīng)用原始菌株接種植物發(fā)病后，對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行致病菌再分離時(shí)，因接種發(fā)病的病原菌很單一，所以可將發(fā)病的小片組織表面消毒后，在無(wú)菌條件下制取植株汁液，稀釋適宜倍數(shù)后進(jìn)行PDA平板涂布，然后挑取單孢菌落。

5 病原菌保存的方法

PDA 2～3 月即需轉(zhuǎn)管一次。礦物油覆蓋保存，雖然保存的菌種存活期較長(zhǎng)，通常2～3 a 才需檢查其存活狀態(tài)，但該種保存效果與操作技術(shù)密切相關(guān)，同時(shí)當(dāng)活化菌種用接種針從礦物油下挑取的菌絲體，因其攜帶有礦物油，所以生長(zhǎng)較慢，一般要再移植1～2 次才能得到良好的菌種。 所用的方法是用2 mL 的小離心管，挑取在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢0.5 cm×0.5 cm 的2～3 塊菌絲塊置于其中，加無(wú)菌水浸沒(méi)菌絲塊并高出菌絲塊0.5 cm，然后將離心管放置于4℃左右的冰箱中，使用時(shí)只需在無(wú)菌條件下，用接種針挑出置于滅菌的濾紙上吸去多余的水分后置于PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)即可。本實(shí)驗(yàn)室用此方法保存的菌株，6 個(gè)月以上仍具有很高的活性。