呂剛 ，魏林 ，梁志懷，馬艷青 ，張屹

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所；4.湖南省蔬菜研究所）

子蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國的特色水生蔬菜之一，其果實——蓮籽可供食用、藥用，其花是中國十大名花之一，深受人們喜愛而廣泛種植[1]。湖南子蓮品種寸三蓮因其品質(zhì)優(yōu)良在清道光、光緒期間作為貢蓮，備受矚目。寸三蓮3顆蓮籽正好1寸（3.3 cm）長，故稱寸三蓮，色白、營養(yǎng)，100 g蓮籽的蛋白質(zhì)含量比雞蛋還高。湖南湘潭縣為寸三蓮的起源地，寸三蓮一直為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟作物，得到大面積推廣種植。目前各寸三蓮種植戶一般都是自行留種進行種植，種植戶之間存在多種寸三蓮品系或株系，品種比較混亂，給湘蓮市場和湘蓮品牌帶來了不利影響。因此很有必要對當(dāng)前混亂的湘蓮品種親緣關(guān)系進行分子檢測分析，從分子水平上探索不同寸三蓮資源的遺傳差異，并最終獲得對寸三蓮典型品系341及其親緣關(guān)系很近的子蓮品種具較好識別作用的鑒定體系。

SRAP標記，相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR的標記系統(tǒng)，由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等[2]于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism SBAP）[2]。該標記通過獨特的引物設(shè)計對ORF（open reading frames）進行擴增，上游引物長 17 bp，5'端前 10個堿基為“填充”序列（filler sequence），無任何特異組成，接著為CCGG序列，它們組成核心序列及3'端3個選擇性堿基，對外顯子進行特異擴增；下游引物長18 bp，5'端前11個堿基為“填充”序列，緊接著是AATT，它們組成核心序列及3'端3個選擇性堿基，對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增。因個體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標記具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標片段的特點，并已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)[3，4]和遺傳多樣性分析。

因此，以前期研究確定田間種植表現(xiàn)型優(yōu)秀、編號為341號的寸三蓮品種為典型品系，以寸三蓮原種場栽種的湖南湘潭縣內(nèi)101份寸三蓮種質(zhì)資源和21份太空蓮等子蓮品種為對比材料，應(yīng)用SRAP技術(shù)，對其鑒定體系進行了試驗研究，初步研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 子蓮樣品的采集

以湘蓮寸三蓮為主要研究對象，收集了包括典型品系341在內(nèi)的湖南湘潭縣寸三蓮品種資源102份，其中排頭鄉(xiāng)29份、龍口鄉(xiāng)16份、烏石鎮(zhèn)14份、石鼓鎮(zhèn)13份、白石鎮(zhèn)10份、中路鋪鎮(zhèn)10份、茶恩寺鎮(zhèn)6份、石潭壩鎮(zhèn)4份。另外還采集了外地品種廣昌蓮和贛蓮62號等外來引進品種21份作為對比材料。

1.2 子蓮樣品的DNA提取

取子蓮幼嫩葉片，液氮研磨粉碎后提取DNA，具體方法：稱取1 g樣品液氮研磨至粉碎，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，再加入600 μL經(jīng)65℃預(yù)熱過的2.5%的 CTAB，65℃水浴 1 h，每隔10 min顛倒混勻一次；加入體積比為 25∶24∶1的酚∶氯仿∶異戊醇 600 μL，充分混勻，冰浴 10 min 后，4℃、12 000 r/min平衡離心20 min；取上清液至另一干凈的離心管中，加入500 μL冰冷的異丙醇，輕輕混勻，放入 4℃冰箱保存 30 min后，4℃、12 000 r/min平衡離心5 min；倒掉上清液，加入1 mL的無水乙醇清洗DNA，離心1 min，倒掉乙醇，晾干后加入50 μL ddH2O。提取結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[5]。

1.3 引物篩選

為篩選出多態(tài)性好、擴增穩(wěn)定的引物組合，利用田間表現(xiàn)型鑒定出寸三蓮品種的典型品系 （編號為341號，來自于排頭鄉(xiāng)長山黃見德）進行SRAP標記技術(shù)用的共計225對引物的篩選。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為12.5 μL，其中ddH2O7.05μL，DNA模板2μL，buffer 1.25 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，Taq酶 0.2 μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min，之后共35個循環(huán) ：94℃ 變 性 20 s，54℃ 退 火20 s，72℃延伸 30 s。最后 72℃延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測進行引物的篩選。

1.4 寸三蓮典型品系341分子標記的確定

利用篩選出的多態(tài)性好、擴增穩(wěn)定的引物組合對所有樣品進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.3。PCR產(chǎn)物通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，尋找能檢測出典型品系341的特異性標記。

2 結(jié)果與分析

2.1 子蓮樣品DNA的提取

應(yīng)用1.2所述的方法，能獲得較好的樣品DNA，結(jié)果見圖1。

圖1 部分籽蓮樣品DNA提取結(jié)果電泳

表1 篩選出的引物序列

2.2 SRAP引物篩選

篩選出了16對多態(tài)性好、擴增穩(wěn)定的引物 ME1+EM3；ME3+EM10；ME4+EM5；ME5+EM1；ME5+EM7；ME6+EM2；ME6+EM4；ME8+EM2；ME8+EM6；ME8+EM12；ME11+EM12；ME12+EM4；ME14+EM3；ME14+EM7；ME14+EM10；ME15+EM9，具體引物序列見表1。

2.3 獲得典型品系341的特異性分子標記

利用篩選出的多態(tài)性較好引物組合進行SRAP分析。其中上游引物ME6（5'-3'TGAGTCCAAACCGGACA）加下游引物 EM2（5'-3'GACTGCGTACGAATTTGC）的引物組合對341號有特異性擴增,擴增條帶長度在390 bp左右（圖2，3）。部分樣品來源如表2所示。試驗結(jié)果還顯示，該特異性分子標記除對典型品系341具有重復(fù)性很好的鑒別作用外，還對供試的123份樣品中其他12份樣品也擴增出了條帶（樣品來源見表3）。溯源這些樣品在田中的表現(xiàn)型，發(fā)現(xiàn)它們的產(chǎn)量、花形、花色及對腐敗病的抗性等都與典型品系341相近。

表2 部分供試樣品來源

表3 具備341號相同特異性條帶的樣品

3 結(jié)論與討論

SRAP技術(shù)也已被應(yīng)用在蓮的遺傳研究上[6～8]。本試驗利用SRAP技術(shù)，首先篩選得到了多組對寸三蓮品種典型品系341擴增穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物組合，再將這些引物同其他101份樣品比較，獲得了ME6+EM2的特異性的分子標記引物，典型品系341擴增出一條約390 bp大小的特異性條帶。由于寸三蓮主要在湖南湘潭地區(qū)種植，具有較強的地域特性，品種之間遺傳距離小，導(dǎo)致區(qū)分難度加大。本試驗開發(fā)的ME6+EM2分子標記，獲得了特異性較高的擴增片段，可以作為品種鑒定的輔助手段，經(jīng)重復(fù)試驗，擴增穩(wěn)定、重復(fù)性好，可以區(qū)分親緣關(guān)系較遠的品種，較大限度地識別寸三蓮的典型品系。但是，由于所獲得的特異性片段為非主擴增帶，難以識別親緣關(guān)系很近的品種，當(dāng)品種間親緣關(guān)系較近時，識別難度加大。如在本試驗中，在供試的123份樣品中還有其他12份樣品也擴增出了與典型品系341一致的特異性條帶，而分析表明，這12份樣品在田中的表現(xiàn)型都與341相近，這可能是由于這些材料與典型品系341有較近的親緣關(guān)系所致。所以為穩(wěn)定湘蓮市場，打造湘蓮品牌，分子手段可以作為一種輔助手段，但實際應(yīng)用時，還應(yīng)該考慮品種的來源并結(jié)合田間栽培的表現(xiàn)型進行鑒定。

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