王培曉，黃麗虹，張 力，陳 虹，張 慶

層粘連蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)、分布及意義

王培曉1，2，黃麗虹3，張 力4，陳 虹2，張 慶2

目的 探討層粘連蛋白(laminin,LN)在乙型肝炎病毒 (hepatitis Bvirus，HBV) 感染相關(guān)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)分布及意義。方法 選取2003-01至2013-05在武警總醫(yī)院施行了原位肝移植手術(shù)的215例HBV相關(guān)性HCC伴肝硬化患者的組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化的方法檢測LN在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，并以30例正常肝組織和良性肝病組作為對照。結(jié)果 LN主要定位于HBV相關(guān)性肝癌組織肝竇竇壁，其次為癌旁間質(zhì)血管與新生血管及細(xì)胞膜/漿。LN在肝癌組織中肝竇竇壁和新生血管的陽性表達(dá)率為70.23%(151/215)，在癌旁組織和良性肝病中肝竇竇壁和新生血管的陽性表達(dá)率分別為57.20%(123/215)和13.33%(3/30)，LN在癌組織中的表達(dá)顯著高于其在癌旁及良性肝病中的表達(dá)(P=0.000)，LN在癌組織中的陽性表達(dá)與微衛(wèi)星灶(P=0.026)、腫瘤數(shù)量(P=0.053)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)顯著相關(guān)。結(jié)論 LN的過表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。

肝細(xì)胞肝癌；乙型肝炎病毒；LN；免疫組化

肝癌是世界上第5位常見惡性腫瘤，全球每年有近50萬人死于肝癌,是近10年來發(fā)病率上升最快的腫瘤之一，其病死率位于因癌癥死亡疾病的第3位[1]。中國是肝癌的高發(fā)區(qū)，約80%以上肝癌發(fā)生與慢性HBV感染有關(guān)，10%與非乙肝非丙肝性因素相關(guān)。然而，肝癌的復(fù)發(fā)率較高，進(jìn)展迅速，對其發(fā)生發(fā)展機(jī)制卻不十分清楚[2]。

層粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)中一種重要的蛋白質(zhì)，是基底膜的重要組成部分，對維持基底膜的完整性起重要作用，且參與細(xì)胞黏附、生長、遷移和分化[3]。有研究提示LN功能結(jié)構(gòu)的異常參與腫瘤細(xì)胞黏附、遷移、分化及血管形成，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移[4]。然而，對其在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及意義的研究還較少，本研究初步探討LN在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)分布及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2003-01至2013-05在武警總醫(yī)院行原位肝移植的患者215例資料，選擇蠟塊保存較好且病理報(bào)告為HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌的病例進(jìn)行研究，年齡15～71歲，平均(50.0±1.4)歲。手術(shù)標(biāo)本經(jīng)40 g/L中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。同時(shí)隨機(jī)選取5例正常肝組織(健康供肝者的肝穿標(biāo)本)及25例良性肝病(酒精性肝硬化5例、布加綜合征5例、肝豆?fàn)詈俗冃?例和自身免疫性肝病5例)組織作為對照組，良性肝病為臨床上確診的病例，以同樣的方法與肝癌蠟塊同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色作為對照組，而且所有標(biāo)記均設(shè)陽性對照并用 P B S 緩沖液代替一抗做陰性對照。一抗抗LN抗體(abcam, English, 貨號ab11575)是鼠抗人多克隆抗體。購二抗為通用型kit，PV-6000 山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，產(chǎn)品編號：PV-6000，規(guī)格為18ml裝。石蠟切片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用器械BM-VX)，電熱常溫干燥箱(上海一恒隔水式GHP-9080)，顯微鏡(OLYMPUS CX21)。

1.2 方法

1.2.1 一步法聚合物檢測系統(tǒng)免疫組化染色 石蠟切片脫蠟水化；放入PBS緩沖液中洗滌3 min×3次，采用高溫高壓法進(jìn)行組織修復(fù)，修復(fù)時(shí)間2.5 min；冷卻降溫后PBS緩沖液洗滌3 min×3次，放入3%的雙氧水中10 min以除去內(nèi)源性過氧化物酶；PBS緩沖液中洗滌3 min×3次，加一抗，4 ℃冰箱過夜；PBS緩沖液中洗滌3 min×5次，加二抗，37 ℃溫育20 min；PBS緩沖液中洗滌3 min×5次， DAB顯色，自來水沖洗, 蘇木素復(fù)染, 0.1%鹽酸分化, 自來水沖洗, 氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥, 中性樹脂封片。

1.2.2 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞膜/質(zhì)的陽性染色呈棕黃色顆粒，強(qiáng)度表達(dá)按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度由弱至強(qiáng)分別記分:無黃色顆粒樣沉淀為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分比對應(yīng)的值：將陽性的細(xì)胞數(shù)<5%算為0分，5%～25%[w5]為1分，25%～50%為2分，>50%為3分，然后將染色強(qiáng)度+陽性細(xì)胞百分比對應(yīng)的值作為評分。>3分為陽性。竇壁及血管染色陽性以在腫瘤竇壁及血管內(nèi)皮出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LN在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)情況 LN主要定位于HBV相關(guān)性肝癌組織肝竇竇壁(圖1A)，其次為癌旁間質(zhì)血管與新生血管(圖1B)及細(xì)胞膜/漿(圖1C)，PBS代替一抗的陰性對照(圖1D)作為對比，顯示陽性染色呈棕黃色顆粒。在癌旁及良性肝病組織表達(dá)明顯較低，且在非瘤組織中竇壁幾乎沒有染色，僅癌周邊間質(zhì)血管及新生血管有染色。本研究中215例HBV相關(guān)性肝癌病例中LN在肝癌組織、癌旁組織和供肝與良性肝病中肝竇竇壁和新生血管上的陽性表達(dá)率見表1，分析結(jié)果顯示，LN在癌組織及癌旁中明顯高于其在供肝與良性肝病的表達(dá)(P=0.000)；LN在肝癌組織、癌旁組織、供肝與良性肝病細(xì)胞膜/漿上的表達(dá)陽性率見表1，分析結(jié)果顯示，LN在肝癌組織中的表達(dá)明顯強(qiáng)于癌旁組織及供肝與良性肝病(P=0.000)，且LN在癌組織(P=0.000)、癌旁(P=0.000)中肝竇竇壁與新生血管的表達(dá)明顯高于在細(xì)胞膜/漿的表達(dá)，但在供肝與良性肝病表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 LN在肝癌肝竇竇壁及新生血管的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 肝癌組織中LN的表達(dá)與肝癌的微衛(wèi)星灶(P=0.026)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)具有明顯的相關(guān)性，與腫瘤數(shù)量(P=0.053)具有相關(guān)的趨勢(表2)。

2.3 LN在肝癌組織細(xì)胞膜/漿的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 肝癌組織中LN的表達(dá)與肝癌的包膜侵犯(P=0.016)有明顯相關(guān)性，與血管侵犯(P=0.054)有相關(guān)趨勢(表3)。

表1 LN在HBV相關(guān)性肝癌、癌旁組織及非癌組織中的表達(dá)情況

表2 LN在HBV相關(guān)性肝癌肝竇的表達(dá)情況 與臨床病理特征的關(guān)系

表3 LN在HBV相關(guān)性肝癌中細(xì)胞膜/漿的表達(dá) 與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 LN在HBV相關(guān)性HCC組織中陽性表達(dá)及陰性對照

A. LN在HBV相關(guān)性肝癌癌巢竇壁染色陽性(200×);B.LN在HBV相關(guān)性肝癌癌旁間質(zhì)血管及新生血管陽性(200×)；C.LN在HBV相關(guān)性肝癌癌巢細(xì)胞膜/漿染色陽性(200×)；D.PBS代替一抗的陰性對照(200×)

3 討 論

肝癌發(fā)生是多因素、多基因參與及多步驟發(fā)展的生物學(xué)過程，癌基因與抑癌基因的異?；罨蛞种?，最終可能引起組織細(xì)胞無節(jié)制的增殖進(jìn)而形成腫瘤。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移同樣是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，是多階段、多步驟、多因素、多基因綜合作用的漫長過程。從癌細(xì)胞脫離母體，經(jīng)過多次侵襲到轉(zhuǎn)移形成，需經(jīng)過兩個(gè)運(yùn)行周期。首先，穿過瘤體基底膜、穿過管壁基底膜進(jìn)入血管或淋巴管和穿出管壁基底膜在適當(dāng)部位著床，穿過這三道屏障到形成轉(zhuǎn)移灶完成第1個(gè)運(yùn)行周期；其次，當(dāng)轉(zhuǎn)移灶形成后開始第2個(gè)運(yùn)行周期，基本同第1個(gè)周期直至宿主死亡。侵襲轉(zhuǎn)移過程中還需要經(jīng)過多次黏附才可完成[5]。LN參與細(xì)胞間基質(zhì)構(gòu)成，與細(xì)胞的黏附、遷移、分化與血管形成密切相關(guān)，并且有研究顯示LN的表達(dá)異常，啟動子低甲基化狀態(tài)下的過表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤[4,7]、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[6]及胃癌[7]的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，同時(shí)也有研究顯示LN功能的異常，在腫瘤組織的過表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌[8，9]及唾液腺腺樣囊性癌[10]的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但LN在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及分布情況尚無報(bào)道。

本研究顯示215例HBV相關(guān)性肝癌病例中LN在肝癌組織肝竇竇壁及新生血管的表達(dá)明顯強(qiáng)于癌旁組織及良性肝病組織(P=0.000)，在未發(fā)生癌病的肝臟組織中未觀察到竇壁染色，癌旁血管多為新生的微血管染色陽性，說明LN在乙肝相關(guān)性肝癌組織的竇壁及新生血管中呈現(xiàn)過表達(dá)。有研究顯示LN可以促進(jìn)新生血管的生成及促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[12-15]，在B16F10黑色素瘤細(xì)胞中，位于層粘連蛋白α1鏈的長臂的SIKVAV肽，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附、侵入和向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移生長及腫瘤血管的生成。LNα1鏈球部的功能多肽AG-73(精氨酸 - 賴氨酸 - 精氨酸 - 亮氨酸 - 谷氨酰胺 - 纈氨酸 - 谷氨酰胺 - 亮氨酸 - 絲氨酸 - 異亮氨酸 - 精氨酸 - 蘇氨酸;(RKRLQVQLSIRT))能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向血管的定位粘附與侵入。因此，筆者推測LN參與腫瘤新生血管的生成。

本研究還發(fā)現(xiàn)，LN的在肝癌組織表達(dá)與肝癌的微衛(wèi)星灶(P=0.026)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)具有顯著的相關(guān)性，提示LN可能與肝癌微衛(wèi)星灶形成及血管侵犯的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步推測LNα1可能參與促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

另外，本研究顯示LN在肝癌組織細(xì)胞膜/漿的表達(dá)明顯強(qiáng)于在癌旁組織及良性肝病組織的表達(dá)(P=0.000)，說明LN在乙肝相關(guān)性肝癌組織的細(xì)胞膜/漿中也呈現(xiàn)過表達(dá)。梅文忠等[11]對膠質(zhì)瘤的研究顯示：LN主要定位于細(xì)胞膜上，LN在細(xì)胞膜的表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞之間或癌細(xì)胞與 ECM 、 血管基膜之間的黏附和遷移。另有研究發(fā)現(xiàn)[12]，LN在與其他因素協(xié)同作用下能夠促進(jìn)人肝細(xì)胞的增殖，如黏附因子黏合素，在缺少該因素的情況下，肝細(xì)胞的存活、增殖顯著降低。LN還可以在促進(jìn)增殖的同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞去分化和異常分化。腫瘤細(xì)胞表面還表達(dá)層黏連蛋白的受體LN-R，為腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移提供了分子基礎(chǔ)。同時(shí)腫瘤細(xì)胞自身也可以分泌層粘連蛋白，促進(jìn)其黏附侵襲和遷移。本研究中LN在肝癌組織細(xì)胞膜/質(zhì)有29.77%的陽性表達(dá)，與肝癌的包膜侵犯(P=0.016)有顯著相關(guān)性，與血管侵犯(P=0.054)有相關(guān)趨勢。推測其參與該機(jī)制促進(jìn)肝癌的侵襲和遷移。但LAMA1基因在癌組織(P=0.000)、癌旁(P=0.000)中肝竇竇壁與新生血管的表達(dá)明顯高于在細(xì)胞膜/質(zhì)的表達(dá)，在良性肝病中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明LN在肝癌組織竇壁與新生血管的表達(dá)比在細(xì)胞膜/漿的表達(dá)更有意義。

綜上所述，LN在竇壁及新生血管壁上的過表達(dá)與血管侵犯、微衛(wèi)星灶、腫瘤數(shù)量及TNM分期具有明顯的相關(guān)性，推測LN可能參與促進(jìn)腫瘤新生血管的生成并與肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但其具體機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

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(2015-05-20收稿 2015-06-20修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

The distribution and the significance of laminin gene expression in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma

WANG Peixiao1,2, HUANG Lihong3, ZHANG Li4, CHEN Hong2, and ZHANG Qing2.

1.Institute of Organ Transplantation, 3.The graduate student affairs office，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing100039,China；2. Graduate Division of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003,China；4.First Department of Surgery; Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Xi’an 710054, China

Objective Investigated the expression of laminin gene in hepatitis B induced-hepatocellular carcinoma(HCC), both of the specificity of the expression. Method Objects were 215 patients of HBV induced-HCCwith cirrhosis in our hospital who had been in the liver transplantation operation from 2003/1 to 2013/5. We examined the expression of laminin in 215 cases of HCC and adjacent tissues by immunohistochemistry.As the normal controls were normal liver tissue and benign liver disease. Results Localization of laminin on hepatic sinusoidal endothelial cell (SEC) and neovascularization of the stromal tissue and membrane / plasma. The expression of the laminin postive on hepatic sinusoidal endothelial cell and neovascularization of the HCC tissues was 70.23%(151/215), with 57.20%(123/215) in cancer adjacent tissues，with 13.33%(3/30)in benign liver diseases tissues. The expression of laminin protein in tumour tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues and benign liver diseases tissues (P=0.000). By clinicopathologic rank correlation analysis， the expression of laminin was associated with tumour microsatellite focal(P=0.026) ,tumor number(P=0.053) , vascular invasion(P=0.005)andTNM(P=0.029). Conclusion laminin expression at the protein levels was also observed in association with developing and metastasisof the hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;laminin; Immunohistochemistry；HBV

首都臨床特色應(yīng)用研究項(xiàng)目(Z121107001012168)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81372595)

王培曉，碩士研究生，E-mail:zqy47@sina.com

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.肝移植科，3.研究生辦；2.453003，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院；4.710054 西安，武警陜西總隊(duì)醫(yī)院普通外科

張 慶,E-mail:xiao.1015.y@qq.com

R730.231