陳 沖，閆俊靈，李 梁，徐 瀟，丁 紅，湯蘇陽

人脂肪來源間充質(zhì)干細胞的制備及其質(zhì)量檢驗方法

陳 沖，閆俊靈，李 梁，徐 瀟，丁 紅，湯蘇陽

目的 研究人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)的制備及其質(zhì)量檢驗方法，為臨床研究提供安全合格的干細胞。方法 取50例人吸脂術抽取的脂肪，剪碎，用胰酶和膠原酶消化、分離、培養(yǎng)，并按照《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則》對其進行細胞形態(tài)、數(shù)量、活率、無菌、支原體、人源特定病毒及豬源病毒、內(nèi)毒素、免疫抑制活性、分化能力、免疫表型等檢測及染色體核型。結果 50例hADSCs；細菌、內(nèi)毒素檢測陰性，無內(nèi)外源致病菌；干細胞免疫表型檢測CD90、CD105表達陽性，陽性率>95%，CD34 、CD45和HLA-DR表達陰性，陽性率<2%；具有成骨、成脂分化潛能；能抑制異體淋巴細胞的增殖。間充質(zhì)干細胞活性凍存前≥92%，凍存復蘇后≥82%。結論 按照本工藝及標準制備的hADSCs符合質(zhì)量控制標準，為同類干細胞制備及其檢定過程標準化提供了試驗依據(jù)。

脂肪干細胞；間充質(zhì)干細胞；質(zhì)量控制；免疫表型；分化潛能；染色體核型分析

人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)，是從脂肪組織中分離獲得的一種具有自我更新及多向分化潛能的干細胞[1]，是極具前景的組織工程和基因治療的種子細胞。由于獲取人體干細胞的來源、制備條件、檢測手段的差異，臨床轉化產(chǎn)生的治療效果參差不齊，甚至帶來不安全隱患，因此干細胞質(zhì)量規(guī)范管理尤為重要。筆者按照國家《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則》，建立hADSCs制備流程及質(zhì)量安全檢驗系統(tǒng)，為臨床應用研究hADSCs提供了安全的保障，同時為同類干細胞制備及檢驗提供標準化流程。我科自2011年9月開展hADSCs提取、分離、培養(yǎng)、鑒定、保存，共計50例，并將其運用慢性創(chuàng)面的治療、軟組織的修復重建、周圍神經(jīng)組織的功能恢復、黏膜組織的再生，取得較好的臨床效果[2]。

1 材料與方法

1.1 組織來源、主要試劑 脂肪組織來自要求進行慢性創(chuàng)面的治療、軟組織的修復重建、周圍神經(jīng)組織、黏膜組織損傷的患者，共50例，年齡25～45歲，無系統(tǒng)性疾病、傳染病和性病。術前均簽訂知情同意書。20 ml注射器建立負壓，用2 mm(外徑)×60 mm的不銹鋼吸脂針抽取脂肪。吸取脂肪15 ml，經(jīng)過紗布過濾后，把已經(jīng)破壞的脂肪細胞、殘留較粗血絲和較大組織塊沖洗掉后，將過濾好的脂肪用無菌容器保存好以制備脂肪干細胞。α-MEM培養(yǎng)液, 間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)液、Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶、胎牛血清、PBS緩沖液、內(nèi)毒素工作標準品等均購自中國食品藥品檢定研究院；梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒、丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒、乙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒、人免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒均購自英國新創(chuàng)科技有限公司。

1.2 儀器 Heal Force二氧化碳培養(yǎng)箱2個購自上海力申科學儀器有限公司，倒置生物顯微鏡及鏡頭相機各1個均購自重慶奧特光學儀器有限責任公司, thermo scientific 2個、全套量程移液器一套、海爾冰箱、SHA-C水浴振蕩器1個均購自金壇市天竟實驗儀器廠，Heal Force生物安全柜1個購自上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 hADSCs制備 脂肪顆粒15 ml，離心1 000 r/min，5 min。取上層脂肪組織及下層細胞。向脂肪組織中加入終濃度0.1%的胰蛋白酶和膠原酶。放入37 ℃的水浴搖床中消化30 min。離心700 g/min，5 min。留取下層細胞，將兩細胞混勻，加PBS緩沖液重懸細胞，再次離心700 g/min，5 min。原代培養(yǎng)液重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。記為P0代。觀察細胞生長情況。首次第3天半量換液，以后每3 d換液一次，細胞達90%融合時傳代培養(yǎng)，用0.05%胰蛋白酶消化，按照1∶4的比例傳代。傳至第3代做鑒定及移植。

1.3.2 細胞形態(tài)及活性 通過光學倒置顯微鏡觀測細胞形態(tài)，通過胎盤藍染色確定細胞數(shù)及細胞活率。

1.3.3 細胞倍增時間測定 分別取第1、3、5代細胞，消化計數(shù)，接種于24孔板內(nèi)，每天細胞計數(shù)，繪制生長曲線。

1.3.4 無菌試驗 按《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄ⅫA無菌檢測法進行；利用全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)：取樣本分別加入至需氧培養(yǎng)瓶(BPA)和厭氧培養(yǎng)瓶(BPN)中。將BPA和BPN置入全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，37 ℃培養(yǎng)7 d。

1.3.5 支原體檢測 按《中華人民共和國藥典》[3]2010年版三部附錄ⅫB支原體檢測法進行。

1.3.6 人源特定病毒檢測 采用ELISA法和實時定量PCR法檢測HCV、HBV、HIV、EBV、CMV、HTLV等人源特定病毒的表達。

1.3.7 豬源病毒檢測 采用ELISA法檢測胰酶中豬細小病毒。

1.3.8 內(nèi)毒素檢測 按《中華人民共和國藥典》[3]2010年版三部附錄ⅫE 細菌內(nèi)毒素檢測法中的方法Ⅰ凝膠法進行。

1.3.9 hADSCs免疫表型鑒定 通過流式細胞儀測定hADSCs表面標記物CD13、CD29、CD31、CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表達情況。

1.3.10 染色體核型分析 取傳代后3～4 d處于增值指數(shù)期的細胞(P3代)，更換新鮮培養(yǎng)液，加入20 μg/ml的秋水仙素125 μl，作用4 h，吸取含秋水仙素的培養(yǎng)液，加入胰酶消化細胞，細胞沉淀用低滲液處理5 min，然后加入固定液固定細胞。進行G帶染色，顯微鏡觀測。

1.3.11 hADSC分化能力檢測 (1)成骨誘導分化。配制成骨誘導培養(yǎng)液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、1, 25-維生素D3)；P3代細胞以2×103個/cm2的濃度接種于6孔板中，等細胞生長至80%融合后，更換為成骨誘導培養(yǎng)液，于誘導2、3周后，進行茜素紅染色，去培養(yǎng)液，PBS洗2次；70%乙醇固定，4 ℃，1 h；PBS洗2次，40 mmol/L茜素紅溶液室溫染色1～10 min。鏡下觀測，照像。(2)成脂誘導分化。除常規(guī)細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)液以外，加0.5 mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、60 μmol/l吲哚美辛、0.5 μmol/L氫化可的松和10 μg/L的胰島素，細胞在此種培養(yǎng)液誘導4周后檢測，去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醛-鈣室溫固定15 min；PBS洗2次，60%異丙醇染1 min；去異丙醇，油紅O工作液室溫染色30 min。60%異丙醇浸洗1次，PBS洗2次，鏡下觀測，照相。

1.3.12 異常免疫學反應 在體外淋巴細胞及樹突狀細胞培養(yǎng)中加入異體hADSCs，作用6 d后，未見淋巴細胞和樹突狀出現(xiàn)明顯的增殖。對照組細胞生長良好。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)及活性 原代培養(yǎng)48 h后80%細胞已貼壁，成梭形(圖1A)。未貼壁的圓形淋巴細胞，經(jīng)過換液、傳代，淋巴細胞基本消失，7 d后細胞基本融合成單層，呈長梭形漩渦狀排列(圖1B)；細胞傳至第2代，未見形態(tài)上有任何差異(圖1C)。錐蟲藍染色結果顯示細胞活率≥92%，凍存復蘇后≥82%。

圖1 原代人來源脂肪干細胞形態(tài)觀察(×40)

A. 接種后48 h倒置顯微鏡下，大部分細胞已經(jīng)貼壁，成梭形，同時混有少量未貼壁的圓形淋巴細胞; B. 接種7 d后倒置顯微鏡下，細胞基本融合成單層，呈長梭形漩渦狀排列; C. 第三代形態(tài)上與接種48 h后相近，細胞呈現(xiàn)旋渦狀生長

2.2 細胞生長情況 CAD軟件顯示，細胞生長曲線第1～2天細胞生長緩慢，第3～5天處于快速增殖期，第7天以后細胞生長緩慢，處于相對停止期，第1、3、5代細胞生長曲線無明顯差異(圖2)。

圖2 人來源脂肪干細胞生長曲線

2.3 無菌試驗 取第3代自體脂肪干細胞，依據(jù)《中華人民共和國藥典》無菌試驗檢測50例，均無細菌生長，全自動微生物培養(yǎng)檢測均為陰性。

2.4 支原體檢測 取第3代自體脂肪干細胞依據(jù)《中華人民共和國藥典》支原體檢測規(guī)程進行，不同時間對同一標本進行檢測，結果均為陰性。50例結果同樣。

2.5 細胞內(nèi)外源致病因子的檢測 50例均取第3代自體脂肪干細胞結合ELISA 和實時定量PCR的方法，對人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、EBV、CMV、HTLV、TP進行檢測，檢測結果均為陰性，因細胞穿代過程中要使用胰酶，因此，利用ELISA的方法檢測豬源細小病毒，結果顯示病毒為陰性。

2.6 內(nèi)毒素檢測結果 50例取第3代自體脂肪干細胞通過凝膠法檢測細胞培養(yǎng)上清中內(nèi)毒素含量為(2.37±1.03)EU/ml。

2.7 hADSCs免疫表型檢測 CD90、CD105表達呈陽性，陽性率>95%；CD34 、CD45和HLA-DR表達陰性，陽性率<2%(圖3)。

2.8 hADSCs染色體核型分析 細胞染色體核型為46XY或46XX，正常率達到100%(圖4)。

2.9 hADSCs的分化能力 hADSCs 經(jīng)成骨誘導后，細胞由長梭形逐漸變?yōu)槎噙呅?、不?guī)則形，1周后細胞開始呈簇狀生長，聚集成團；2周時細胞團逐漸增大，4周時可見明顯的鈣結節(jié)形成；行茜紅素染色，鏡下見紅色鈣結節(jié)(圖5A)。hADSCs經(jīng)成脂誘導后，細胞生長緩慢，逐漸由長梭形變?yōu)槎噙呅?、圓形、橢圓形，細胞體積減小。1周后細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴并逐漸聚集，2周時可見大量脂滴形成，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸增多增大，4周時多數(shù)細胞被誘導成脂肪樣細胞，油紅O染色陽性，可見明顯的脂肪形成(圖5B)。

2.10 異常免疫學反應 hADSCs對人淋巴細胞及樹突狀細胞的增殖具有抑制作用。

圖3 人脂肪來源間充質(zhì)干細胞免疫表型

圖4 人脂肪來源間充質(zhì)干細胞染色體核型分析

細胞染色體的形態(tài)、結構和數(shù)目均未見異常，呈二倍體結構，顯示其核型是穩(wěn)定的

圖5 第2代人脂肪干細胞成骨和成脂誘導培養(yǎng)

3 討 論

hADSCs是來源于脂肪組織的一類具有增殖能力強和多項分化潛能的成體干細胞，在特定條件下可以向肌肉、軟骨、脂肪、表皮，造血、神經(jīng)等中胚層來源的組織細胞分化，具有取材容易、創(chuàng)傷小、細胞增殖快、不會引起倫理學爭議等優(yōu)點。國內(nèi)外已開展多項hADSCs臨床應用研究，主要包括骨關節(jié)疾病、創(chuàng)面修復、組織填充、心血管疾病等多個方面[ 4-7]。

目前，間充質(zhì)干細胞分離方法主要包括膠原酶消化法或組織塊貼壁分離等方法[8]。膠原酶消化法獲去脂肪干細胞，操作復雜，藥品用量不易控制，難于規(guī)范，直接影響細胞的產(chǎn)出及質(zhì)量安全。單純酶消化法雖然一次可獲得較大的細胞量，但組織需要經(jīng)過中性蛋白酶和胰酶、蛋白酶兩次消化處理，而后者對細胞的損傷作用已被證實。尤其對于貼壁依賴性細胞來說，細胞膜表面分泌形成的黏蛋白膜，使細胞易于黏附支持物表面。細胞消化時，如果當胰酶將細胞分泌的黏蛋白膜水解后未能及時終止其作用，胰酶有可能對細胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)發(fā)動進攻，造成其解離，進而誘導細胞發(fā)生凋亡。組織塊貼壁分離法在實際操作中得到的仍是一種混合細胞，其中混雜有部分前體細胞，如何純化獲得單純脂肪干細胞，是該方法主要的問題。本研究聯(lián)合酶消化法和組織塊法的優(yōu)點，采用低轉速離心細化脂肪組織，減少對脂肪細胞的破壞，減少膠原酶用量，酶消化時間短，減少了細胞損傷、污染的概率，提高細胞的活性，降低誘導細胞凋亡的因素，細胞產(chǎn)率高，傳代后細胞形態(tài)及增殖活性最穩(wěn)定，操作更加簡單，更節(jié)約了成本。

本研究根據(jù)國家2014年《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則》對hADSCs進行細胞形態(tài)、數(shù)量、活率的檢定。錐蟲藍染色結果顯示細胞活率≥92%，凍存復蘇后≥82%。并按《中華人民共和國藥典》對hADSCs進行無菌、支原體、人源特定病毒、豬源病毒、細菌內(nèi)毒素等一系列檢測；確保hADSCs無菌、無內(nèi)毒素、無內(nèi)外源致病因子；行茜紅素染色，鏡下見紅色鈣結節(jié)。油紅O染色陽性，可見明顯的脂肪形成。結果顯示，hADSCs具有成骨和成脂等多向分化的潛能。

流式細胞學檢測證實，實驗產(chǎn)出的hADSCs具有與其他來源問充質(zhì)干細胞相似的性質(zhì)，包括細胞形態(tài)、免疫表型、增殖活性[9]。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)，與骨髓問充質(zhì)干細胞相似，hADSCs免疫標志物表達水平會隨著傳代發(fā)生變化，CD90、CD105表達呈陽性，陽性率>95%；CD34、CD45和HLA-DR表達陰性，陽性率<2%。CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等隨著傳代次數(shù)增多表達會明顯增強，而標志物CD44一直持續(xù)高表達。證實本研究分離培養(yǎng)的hADSCs可能更均一，在本培養(yǎng)體系中性質(zhì)更穩(wěn)定。細胞表型的研究對于干細胞的檢定及干細胞誘導分化條件、過程、及結果的研究都具有指導作用[10]。

hADSCs與干細胞有相近的低免疫源性，同時具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，可以抑制淋巴細胞、樹突狀細胞的增殖和降低其功能[11]。為了防止出現(xiàn)異常免疫反應，本實驗用對照比較測定了對淋巴細胞的抑制作用。

本研究按照國家《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則》和《中華人民共和國藥典》分離培養(yǎng)檢定hADSCs，并結合hADSCs的特點，進行制備和檢定，可以取得細胞數(shù)量可觀、增殖活性穩(wěn)定、質(zhì)量可靠的、安全應用臨床的間充質(zhì)干細胞。

[1] 李 輝，李 巧，左振宇，等. 人、大鼠和豬誘導多能干細胞染色體制備方法的建立和關鍵影響因素的分析[J]. 細胞生物學雜志，2009, 31(3)：443-447.

[2] 湯蘇陽,李 彥,閆俊靈,等. 體外擴增的自體脂肪干細胞介導自體脂肪移植的臨床研究[J]. 中國生物醫(yī)藥技術, 2013, 8(6): 433-438.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版) 三部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 附錄95-98.

[4] 李 梁，賈德進，閆俊靈，等. 體外擴增自體脂肪干細胞對空鼻綜合征患者粘膜功能重建的臨床研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2014,51(10)：1577-1580.

[5] 吳 瑜, 馮建平, 林 林, 等. STR 圖譜分析法鑒別人源細胞交叉污染.中國生物制品學雜志, 2010,23(1):74-86.

[6] 閆俊靈, 狄國虎, 丁 紅, 等. 脂肪干細胞介導的自體脂肪移植隆胸[J]. 中國組織工程研究, 2013,17(5):878-885.

[7] Zuk P A, Zhu M, Mizuno H,etal. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies[J]. Tissue Eng, 2001,7(2):211-226.

[8] Salem H K, Thiemermann C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status [J]. Stem Cells, 2010, 28(3): 585-596.

[9] Chamberlain G, Fox J, Ashton B,etal. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing [J]. Stem Cells, 2007, 25(11): 2739-2749.

[10] Zavan B, Michelotto L, Lancerotto L,et al. Neural potential of a stem cell population in the adiposeand cutaneous tissues[J]. Neurol Res, 2010,32(1):47-54.

[11] Lobna A. Aly. Efficiencyof systemic versus intralesional bone marrow-derived stem cells in regenerationof oral mucosa after induction of formocresol induced ulcers in Dogs[J]. DentRes J (Isfahan), 2014,11(2):212-221.

(2014-11-20收稿 2014-12-16修回)

(責任編輯 武建虎)

Human adipose derived mesenchymal stem cells and its quality test preparation

CHEN Chong, YAN Junling, LI Liang, XU Xiao, DING Hong, and TANG Suyang.

Department of Skin Regeneration Medicine, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To study the human adipose derived mesenchymal stem cellsinvitroamplification and quality inspection methods and provide safe and qualified stem cells for clinical research. Methods Fifty human source liposuctioned fat, sheared, underwent trypsin and collagenase digestion, separation, culture, and according to the “stem cell-based medicinal product quality control of pre clinical research guiding principle” to detect the cell morphology, quantity, live rate, sterilization, mycoplasma, human source specific virus and swine virus, endotoxin, immunosuppressive activity, differentiation ability, immunophenotype detection and chromosome karyotype. Results Human adipose derived mesenchymal stem cell activity before cryopreservation is ≥92%, after revival≥82%; bacteria and endotoxin test negative, no internal and external source pathogenic bacteria; stem cell immunophenotype detection of CD90, CD105 positive, the positive rate>95%, CD34, CD45 and HLA-DR negative expression, the positive rate<2%; with osteogenic and adipogenic differentiation proficiency ,it can inhibit the proliferation of allogeneic lymphocytes. Conclusions The preparation process and the standard of human adipose derived mesenchymal stem cell line according to the quality control standard of “stem cell-based medicinal product quality control of pre clinical research guiding principle”, it provides the experimental basis for the similar stem cell preparation and standardizing verification process.

adipose derived stem cells; mesenchymal stem cells; quality control; immunophenotype; differentiation; karyotype analysis

陳 沖，大專學歷，護士，E-mail: 53193228@qq.com

100039北京，武警總醫(yī)院皮膚再生醫(yī)學科

湯蘇陽，E-mail: 2278645614@qq.com

R329.2