屈 鋒 陜西省涇陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 713700

王敏杰 陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 719000

豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析

屈 鋒 陜西省涇陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 713700

王敏杰 陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 719000

我國多個省份的大規(guī)模養(yǎng)豬場都出現(xiàn)過新生仔豬神經(jīng)疾病和死亡的案例，為了確定是否豬偽狂犬病病毒的感染所致，本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品，采用PCR方法對死亡仔豬腦組織中擴增PRV的gE基因，進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析。將疑似PR病毒發(fā)病豬的腦部組織進行勻漿，提取其DNA進行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染。結(jié)論：依據(jù)本次實驗結(jié)果進行推測，當(dāng)下各個豬場流行的PRV病毒可能存在一定的抗原變異。

豬偽狂犬病病毒；新流行株；分離鑒定；抗原差異性分析

在現(xiàn)代臨床研究治療中，由PR病毒所引起的豬急性傳染病就是豬偽狂犬病，PRV病毒會導(dǎo)致不同年齡段的豬被感染，其中又以哺乳豬仔和妊娠期母豬感染最為嚴(yán)重，致使哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經(jīng)疾病、器官衰竭直至死亡，致使妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎，此類感染PRV病毒的死亡率達到100%。對于PRV病毒病，我國大型養(yǎng)豬場均采用PRV基因缺失疫苗進行預(yù)防和治療，大體上取得了較好的效果。但是從2011年以來，很多采用PRV基因缺失疫苗進行預(yù)防和治療的大型養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了疑似PR病毒，臨床表現(xiàn)為母豬產(chǎn)死胎、弱仔，哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹、神經(jīng)疾病及死亡。本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析，結(jié)果顯示，這些豬場所流行的PRV病毒擁有某種程度的抗原變異。

1 資料與方法

（1）臨床資料。選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析，PRV經(jīng)典強毒雙城株和PRV疫苗株都在本院實驗室進行保存。對來自我國河南、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、江蘇等多個省區(qū)的13個PR免疫豬場送檢的懷疑是PR的豬腦組織156份病毒樣品，選取適量豬腦組織進行勻漿，依據(jù)臨床操作準(zhǔn)則，一部分勻漿液體用于病毒的分離鑒定，一部分用于提取病毒基因組的DNA進行PCR鑒定。

（2）實驗對象和細胞。實驗豬和小鼠購買自獸醫(yī)研究所，Vero細胞在本實驗室進行保存。

（3）引物的設(shè)計和合成。依據(jù)GenBank中所登記的PRV基因序列分別設(shè)計用來gE全基因擴增和序列分析的引物和擴增部分的gE基因的檢測引物。

（4）病毒基因組的提取和PCR擴增以及病毒的分離。病毒基因組的提取和PCR擴增參考文獻[1]所描述的方法進行臨床操作。病毒的分離是將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿，采用過濾器進行過濾和除菌以后，取接種的Vero單層細胞，進行孵化孕育1小時后，更換含有2%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液體，觀察細胞的病變，等待70%左右的細胞出現(xiàn)CPE時收毒，進行凍融一次以后，連續(xù)在Vero細胞中傳代擴大培養(yǎng)。

（5）電鏡觀察病毒粒子。選取Vero細胞培養(yǎng)的病毒液體，采用2%的磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒的粒子形態(tài)。

（6）小鼠的感染實驗。選取6～8周的55只小鼠，25只接種10×倍比稀釋的PRV-S強毒株，25只接種10×倍比稀釋的F5代分離株，經(jīng)過腹股溝皮下接種0.1mL，對另外5只小鼠注射等體積的DMEM培養(yǎng)液體來作為陰性對照。觀察小鼠的臨床癥狀和死亡狀況，依據(jù)Reed Muench方法進行計算其LD50。

（7）病毒的中和實驗。對新分離的病毒接種豬血清和疫苗株Bartha k61接種豬血清，采用固定病毒稀釋血清方法測定兩株病毒的中和抗體。

2 結(jié)果

病毒資料檢測。將疑似PR病毒的發(fā)病豬的腦部組織進行勻漿，提取其DNA進行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染。

病毒的分離及鑒定。將少部分豬腦腦組織勻漿液體過濾除菌接種Vero細胞，48小時可以觀察到網(wǎng)狀的細胞病變。進行PCR鑒定，可以擴增到預(yù)期的大小片段，采用豬圓環(huán)病毒、豬繁殖、豬瘟和呼吸綜合征病毒特異性物擴增，都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。電鏡檢測，觀察到病毒的粒子呈圓形，臨床體征有實心和中心，分為沒有囊膜和有囊膜兩種。

gE基因序列的分析。最近分離的PRV都處于相對獨立的分支中，和以往分離的病毒株親緣關(guān)系比較遠。

小鼠的感染實驗。小鼠接種的PRV-S強毒株和F5代分離株都出現(xiàn)了PR臨床癥狀，發(fā)病白鼠撕咬接種的部位，致使局部皮膚出血、皮毛脫落、撕咬肢體，病毒接種量達到103.0～106.0的TCID50的小鼠72小時后死亡，F(xiàn)5代分離株小鼠的 LD50為 103.37 TCID50，PRV-S小鼠的LD50為103.83 TCID50，注射DMEM培養(yǎng)液體的對照組小鼠沒有臨床癥狀。

血清交叉中和實驗。疫苗株Bartha k61接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平和病毒接種豬血清相比比較低，可以50%中和自身病毒的血清稀釋度都在1∶20～1∶40。對于分離病毒接種豬血清的中和能力更加低，分離病毒接種豬感染2周就可以產(chǎn)生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度都在1∶80以上，對兩種病毒的中和能力都比較。

3 討論

危害養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重傳染病就包括豬偽狂犬病，對豬偽狂犬病的預(yù)防主要依靠基因缺失疫苗的接種[2]。

采用微量中和實驗進行血清學(xué)進行分析，Bartha k61接種豬血清所產(chǎn)生的中和病毒接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平比較低，對新分離的病毒接種豬血清產(chǎn)生的抗體水平較高，表明PR當(dāng)下流行的病毒株和疫苗株之間在抗原性上存在一定的差異。

[1]彭金美，王瑜，田志軍，等．帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其體外生長特性研究[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，31 (1)：10-15．

[2]童光志，周艷君，郝曉芳，等．高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析 [J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，29(5)：323-327．